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  山东大学耳鼻喉眼学报  2016, Vol. 30 Issue (1): 1-4  DOI: 10.6040/j.issn.1673-3770.0.2015.487
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引用本文 

邓玉琴, 杨雅琪, 陶泽璋, 孔勇刚, 许昱, 陈始明, 肖伯奎. 微小RNA单核苷酸多态性与中国南方汉族人群变应性鼻炎易感性的研究[J]. 山东大学耳鼻喉眼学报, 2016, 30(1): 1-4. DOI: 10.6040/j.issn.1673-3770.0.2015.487.
DENG Yuqin, YANG Yaqi, TAO Zezhang, KONG Yonggang, XU Yu, CHEN Shiming, XIAO Bokui. Study on single-nucleotide polymorphisms of microRNA and susceptibility to allergic rhinitis in Han population of southern China[J]. Journal of Otolaryngology and Ophthalmology of Shandong University, 2016, 30(1): 1-4. DOI: 10.6040/j.issn.1673-3770.0.2015.487.

基金项目

国家自然基金青年项目(81300813);武汉大学专项科研基金(302274669)

作者简介

邓玉琴。E-mail:bamboo0723@126.com

通讯作者

陶泽璋。E-mail:taozezhang@hotmail.com

文章历史

收稿日期：2015-11-17
网络出版时间：2016-01-05 09:00
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微小RNA单核苷酸多态性与中国南方汉族人群变应性鼻炎易感性的研究
邓玉琴, 杨雅琪, 陶泽璋 , 孔勇刚, 许昱, 陈始明, 肖伯奎    
武汉大学人民医院耳鼻喉头颈外科, 湖北 武汉 430060
收稿日期：2015-11-17; 网络出版时间：2016-01-05 09:00
基金项目：国家自然基金青年项目(81300813);武汉大学专项科研基金(302274669)
作者简介：邓玉琴。E-mail:bamboo0723@126.com
通讯作者：陶泽璋。E-mail:taozezhang@hotmail.com
摘要: 目的 通过分析微小RNA(microRNA， miRNA)单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms， SNP)与变应性鼻炎易感性的关系，探索新的变应性鼻炎易感性分子标志物。方法 选取216例变应性鼻炎患者设为变应性鼻炎组，另选取同期84名健康人群设为对照组，采集两组外周静脉血，提取基因组DNA，利用焦磷酸测序技术检测pre-miR-146a的SNP，分析其基因多态性位点rs2910164的基因型及等位基因频率。 结果 变应性鼻炎组pre-miR-146a(rs2910164)的CC基因型频率及等位基因C的频率显著高于对照组(P＝0.031)。从基因型频率的相对风险分析发现，CC基因型患变应性鼻炎的风险增加 (OR=1.799，95%CI:1.042～3.107) (OR＝1.348，95%CI: 1.036～1.754)。 结论 pre-miR-146a(rs2910164)的SNP可能与中国汉族人群变应性鼻炎易感性相关，其突变位点可能是变应性鼻炎易感性的分子标志物。
关键词: 变应性鼻炎    微小RNA    单核苷酸多态性    
Study on single-nucleotide polymorphisms of microRNA and susceptibility to allergic rhinitis in Han population of southern China
DENG Yuqin, YANG Yaqi, TAO Zezhang , KONG Yonggang, XU Yu, CHEN Shiming, XIAO Bokui    
Department of Otolaryngology & Head and Neck Surgery, People's Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei, China
Abstract: Objective To explore the new molecular markers of susceptibility to allergic rhinitis by analyzing the relationship between single nucleotide polymorphisms (SNP) of microRNA (miRNA) and susceptibility to allergic rhinitis. Methods A total of 216 patients with allergic rhinitis were collected as the allergic rhinitis group, and 84 healthy people at the same term were collected as the control group. The peripheral venous blood was drawn in both groups, and genome DNA was extracted. The SNP of pre-miR-146a was detected using pyrosequencing technique to analyze its gene polymorphic site rs2910164 genotype and allele frequency. Results Both CC genotype frequency and allele C frequency of pre-miR-146a (rs2910164) in the allergic rhinitis group were dramatically higher than in the control group (P＝0.031). Through analysis on the relative risk of genotype frequency, it was found that the risk of patients with CC genotype who suffered from allergic rhinitis increased (OR＝1.799, 95% CI: 1.042-3.107), and the risk of those with allele C who suffered from allergic rhinitis also increased when compared with allele G (OR＝1.348, 95% CI: 1.036-1.754). Conclusion The SNP of pre-miR-146a (rs2910164) may be associated with susceptibility to allergic rhinitis in Chinese Han population, and its mutation sites may be the molecular markers of susceptibility of allergic rhinitis.
Key words: Allergic rhinitis    microRNA    single-nucleotide polymorphisms    

变应性鼻炎发病机制非常复杂，是环境和遗传因素共同作用的结果。基因多态性在变应性鼻炎发病机制中发挥重要作用，一旦机体受到花粉、尘螨、化学物质等因素刺激，部分非表达状态的基因开始表达致人体处于致敏状态，可表现出变应性鼻炎症状。人类基因组最常见的基因多态性是单核苷酸多态性[1](single-nucleotide polymorphisms，SNP)，即出现在基因组DNA分子的特定位置的单个核苷酸的置换，它是导致药物反应性和疾病易感性个体及种族差异的重要原因之一。本研究采用病例对照的方法，采用焦磷酸测序PSQ96微测序分析比较两组变应性鼻炎患者miRNA前体区域hsa-mir-146a基因多态性位点rs2910164的基因型及等位基因频率，探讨其位点基因多态性与中国南方地区汉族人群变应性鼻炎的相关性。

1 资料与方法 1.1 一般资料

选择2009年5月至2014年3月就诊于武汉大学人民医院耳鼻喉头颈外科的216名变应性鼻炎患者设为变应性鼻炎组，均有变应性鼻炎的典型症状，并经过粉尘螨、屋尘螨、艾蒿、豚草、花粉等八种变应原皮肤点刺试验检测(阿罗格点刺液，德国)和户尘螨/粉尘螨、矮豚草/高葎草、霉菌、动物皮屑等六种变应原血清特异性免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)检测,至少有一种变应原反应试验阳性，试验结果与病史相一致，符合中华医学会耳鼻喉科学分会变应性鼻炎诊断标准[2]。其中男103例，女113例；平均(34.30±14.38)岁。 另选取84名健康人群设为对照组，均无变应性鼻炎、哮喘等变应性疾病病史，皮肤点刺试验和变应原血清特异性IgE检测结果均为阴性。其中男44例，女40例；平均(43.30±11.53)岁。所有研究对象均通过问卷调查和当场询问的方式了解病史资料，包括家族史、母孕期有无致敏及用药史、出生时是否早产、生活环境、是否养宠物等，建立详尽资料档案。研究对象均为汉族成年人群，居住于湖北、湖南、江西及广东等中国南方地区，均签署知情同意书。两组一般资料比较见表 1。

表1 两组一般资料比较 Tab. 1 Comparison of the general data in both groups
1.2 研究方法 1.2.1 基因组DNA提取

两组均采集外周静脉血5 mL，EDTA-K2抗凝，-20 ℃暂存，按基因组DNA提取试剂盒(血液DNA提取试剂盒，北京天根生物工程有限公司)操作说明提取DNA，-20 ℃保存。

1.2.2 引物设计与合成

所有寡核苷酸引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成，上游引物序列为5′-ACG TTG GAT GGA ACT GAA TTC CAT GGG TTG- 3′,下游引物序列为5′-ACG TTG GAT GCC ACG ATG ACAGAG ATA TCC-3′。

1.2.3 聚合酶链反应(PCR)

PCR反应体积50 μL，含10×PCR反应缓冲液4 μL，25 mmol/L MgCl2、25 mmol/L dNTP各1 μL，100 μmol/L PCR正向引物及反向引物各1 μL，Taq DNA聚合酶2 U及基因组DNA模板2 μL(约200 ng)。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共循环30次，随后72 ℃延伸5 min。所有过程均在ABI公司9700型PCR仪上完成。

1.2.4 单链DNA模板的制备

在40 μL PCR扩增产物中加入36 μL结合缓冲液(Pyrosequencing，AB公司)及4 μL链亲和素(strepta-vidin)包被的磁珠，室温下孵育5 min，用Pyrosequencing AB公司专用单链纯化装置吸取吸附有PCR产物的琼脂糖珠。依次用70%乙醇、变性缓冲液及清洗缓冲液各清洗15 s，然后将琼脂糖珠转移到预先加有45 μL退火缓冲液(含0.3 μmol/L测序引物)的pyro96孔板中。

1.2.5 焦磷酸测序

实时焦磷酸测序在PSQ96微测序仪进行，采用Pyrosequencing公司PSQ96 SQATM试剂盒，参照试剂盒操作说明进行。将PSQTM 96孔板中，置于80 ℃变性2 min，待冷却至室温后，将96孔板放入PSQ96测序仪样本舱中，PSQ96-SQATM酶混合物(包括DNA Polymerase、 ATP Sulfurylase、Luciferase、Apyrase)和底物混合物(包括APS、Luciferin)加入SQA反应筒中，测序反应自动进行。测序反应图像和数据由PSQ96 MA2.1软件分析处理，得到SNP测定结果。采用FINETTI软件分析等位基因频率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件处理数据，基因型和等位基因频率采用频率计数法计算，基因型及组间等位基因频率比较采用χ2检验。不同基因型与疾病之间的关系采用方差分析。检验水准取α＝0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 Pre-miR-146a(rs2910164)位点基因型和等位基因频率比较

Pre-miR-146a(rs291016)位点，变应性鼻炎组的GG基因型 51例(23.61%)，CG 基因型111例(51.39%)，CC 基因型54例(25.00%)；G 等位基因频率为49.30%，C 等位基因频率为 50.70%。对照组的GG基因型30例(35.71%)，CG基因型40例(47.62%)，CC基因型14例(16.67%)；G 等位基因频率为59.50%，C 等位基因频率为40.50%。变应性鼻炎组与健康组之间CC基因型差异有统计学意义(P＝0.031),变应性鼻炎组CG基因型的分布与对照组CG基因型相比，差异无统计学意义(P＝0.101)。

2.2 Pre-miR-146a(rs2910164)位点等位基因与变应性鼻炎发病危险性的关系

相对于等位基因G，等位基因C可能增加变应性鼻炎发生的危险性，OR值(95% CI)为1.348(1.036～1.754)，P＝0.029。相对于GG基因型，CC基因型可能增加发病风险，95%CI为1.799(1.042～3.107)，P＝0.031。见表 2。

表2 Pre-miR-146a(rs2910164)位点等位基因与变应性鼻炎发病危险性的关系[n(%)] Table 2 Relationship between pre-miR-146a (rs2910164) alleles and the attack risk of allergic rhinitis[n(%)]
3 讨 论

变应性鼻炎是遗传和环境因素共同影响的多基因疾病，基因多态性是决定个体易感性和临床转归的一个重要因素。微小RNA (microRNA，miRNA)是一类在转录后基因调控中发挥重要作用的内源性表达的小分子非编码RNA[3]。目前，有学者认为，出现在miRNA或其结合部位的SNP是导致其遗传变异的的异常源头，从而导致疾病易感性的差别[4]。靶序列的SNP充当了microRNA调控的“开关”，即包含某等位基因型的靶序列可以被microRNA结合，相当于开启了microRNA的调控，使相关靶基因低表达；而包含另一种等位基因型的靶序列不能被microRNA结合，则关闭了microRNA的调控功能，使相关靶基因高表达。尽管大多数 SNP并不影响基因的功能，但一些特定区域的SNP可以使机体容易罹患疾病，增加发病风险。miRNA基因序列中的SNP与变应性疾病易感性关系的研究，开启了探索变应性疾病分子生物学发病机制的新途径。

近年来研究表明，靶基因miRNA结合位点存在SNP，这些SNP通过影响miRNA与靶基因的结合，影响机体发生多种疾病的风险。Yang等[5]发现，位于GEMIN3基因miRNA结合位点的SNP(rs197414)与膀胱癌发病密切相关，其中CC型和CA型可以显著增加膀胱癌发病风险。Landi等[6]通过研究54个miRNA靶点基因SNP与结肠直肠癌易感性的相关性发现，CD86基因和INSR基因上miRNA靶点SNP变异均可显著增加结肠直肠癌的发病风险,从而影响相关疾病的易感性。

迄今为止，尚未见调控miRNA靶序列的单核苷酸多态性与变应性鼻炎易感性的系统研究。仅Zheng等[7]研究发现HLA-G基因3′UTR区的SNP影响miR-148a、miR-148b和miR-152与HLA-G结合，与哮喘的发病风险密切相关，但该研究存在明显的局限性，未对3＇UTR区的SNP如何参与调控miRNAs与HLA-G的结合做进一步探讨。国外文献报道microRNA的SNP与过敏性疾病的关联性，仅在动物试验中研究[8]，未在人群中验证。有文献报道，miR-146a在小鼠辅助性T细胞(helper T cell，Th)1及Th2上均有表达，参与白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)诱导的炎症反应[9]并通过下调IL-1受体相关激酶-1(IL-1 receptor-associated kinase，IRAK-1)的表达参与Toll样受体2(Toll-like receptor 2，TLR2)的信号传递[10]。miR-146a的SNP与人类甲状腺乳头状癌的发病风险相关。miR-146a(rs2910164)位点中等位基因C可能增加哮喘发生的危险[11]，hsa-mir-146a 其CC 基因型可显著增加儿童变应性皮炎的发病风险[12]。综合国内外研究，我们推测靶基因miRNA-146a结合位点中必定存在某些SNP，通过调控miRNA靶基因的功能，从而影响变应性鼻炎的发生发展，“SNP-miRNA-靶基因轴”在变应性鼻炎发病中可能扮演重要角色。

本研究发现，相对GG基因型而言，pre-miR-146a(rs2910164) 位点的CC基因型可能增加变应性鼻炎发生的危险性,且相对等位基因G而言，等位基因C也可能增加变应性鼻炎发生的危险。分析其可能机制是，等位基因C可能影响了pre-miR-146a水平，从而影响一系列下游靶基因水平，激活体内炎症免疫反应，从而增加变应性鼻炎发病的风险。

综上，miRNA前体区域hsa-mir-146a基因多态性位点 rs2910164 CC基因型可显著增加中国南方地区人群变应性鼻炎的发病风险，但其具体机制有待进一步验证。

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