2016, Vol. 30
2.首都医科大学附属北京世纪坛医院耳鼻喉头颈外科, 北京 100038;
3.首都医科大学附属北京世纪坛医院中心实验室, 北京 100038
2.Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Beijing Shijitan Hospital of Capital Medical University, Beijing 100038, China;
3.Central Laboratory, Beijing Shijitan Hospital of Capital Medical University, Beijing 100038, China
慢性头痛一直是困扰人类健康的常见症状，患病率为3.2%～3.5%[1]。部分患者的头痛因鼻部解剖异常引起，国际头痛分类标准-2中将此类头痛称为黏膜接触点性头痛，属于继发性头痛[2]，其发病机制至今尚不明确，临床多认为该疾病与黏膜接触点的机械挤压密切相关[3]。随着免疫学和分子生物学的发展，NK-1受体(NK-1receptor,NK-1R)作为介导疼痛的受体被广泛研究[4]，目前其与黏膜接触点性头痛的相关性研究尚不多见。本研究应用免疫组织化学(免疫组化)技术检测接触点和非接触点鼻黏膜组织中NK-1R的表达差异，应用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-PCR，RT-PCR)技术检测部分NK-1R表达阳性的接触点和非接触点鼻黏膜组织中的NK-1R和P物质(Substance P，SP)的m RNA水平，验证两者结果是否吻合，进而探讨NK-1R在黏膜接触点性头痛中的作用。
1 资料与方法 1.1 一般资料选取2014年3月至2015年4月手术治疗的18例黏膜接触点性头痛患者为研究对象，其中男12例，女6例； 16～64岁，中位年龄31.5岁；病程0.5～10年，中位病程3年；手术方式：鼻中隔偏曲矫正＋双下甲外移术8例；鼻中隔偏曲矫正＋双中甲部分切除＋双下甲外移并等离子消融术5例；鼻中隔偏曲矫正术3例；左筛窦切除＋双中甲部分切除＋双下甲外移术1例；鼻中隔偏曲矫正术＋左侧钩突切除＋双下甲外移术1例。患者主要症状为头痛，疼痛部位以前额、颞部、眶周、枕部为主，疼痛性质以沉重压迫感为主。本研究通过医院伦理委员会审查，受试者均已签署知情同意书。
1.2 标本采集实验标本分别取自接触点的鼻甲黏膜组织和患侧中鼻甲前端黏膜组织。两个位置各取一块，4 mm×4 mm×5 mm大，切开后分别用于免疫组化和RT-PCR实验。获取新鲜组织后，立即切成块状并投入液氮，于-80 ℃超低温冰箱中保存待测。
1.3 免疫组化常规石蜡包埋组织标本，经切片、脱蜡、水化，按照ABC法进行免疫组化检测，一抗为稀释度1∶100的鼠抗NK-1R抗体(Abcam公司)，二抗为鼠抗羊IgG(DaKo公司)，DAB(DaKo公司)显色，苏木精复染，逐步脱水，二甲苯透明，最后用中性树脂封片。用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。
阳性结果判定：阳性染色表现为棕黄色，随机计数10个高倍视野(×400)，计数每个视野阳性细胞数，计算阳性率，并取平均值。所有切片均由2名有经验的病理科医师采用盲法阅片，若结果不一致，请第3人重新阅片。评分标准，阴性为0分，1％～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，76％～100％为4分。着色强度：无着色为0分，浅黄色为1分，浅棕色为2分，深棕色为3分。将着色强度和阳性率两项评分相加的总分进行统计分析。
1.4 RNA 提取和逆转录总RNA的提取按照Trizol一步法，紫外分光光度计(Thermo Scientific NanoDrop 2000)测定其浓度和纯度，总RNA 被逆转录成cDNA (Roche公司逆转录试剂盒)，逆转录所得cDNA于－20 ℃冰箱保存。
1.5 RT-PCR 检测该实验基于5’核酸分析法进行RNA 精确定量分析，应用NCBI上的Primer-BLAST软件自行设计NK-1R、SP及内参β-actin的引物，交由北京赛百盛基因技术有限公司合成。引物序列见表 1。反应条件：95 ℃ 10 min； 95 ℃ 30 s、60 ℃ 60 s，扩增40个循环。采用相对标准曲线法进行数据分析[5]，依次将实验重复2遍。以RQ值代表接触点较非接触点组织中SP及NK-1R mRNA的表达趋势。RQ＞1表明mRNA表达上调，RQ＜1表明mRNA表达下调。
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表1 引物序列 Tab. 1 Primer sequence |
运用SPSS 16.0软件进行数据分析。NK-1R的免疫组化结果采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 NK-1R在接触点和非接触点鼻腔黏膜组织中的表达18例接触点和非接触点鼻黏膜组织中，17例(94.4%)接触点标本着色，4例(22.2%)非接触点标本着色，1例(5.6%)接触点和非接触点标本均未着色。接触点鼻腔黏膜组中NK-1R主要表达于腺体上皮细胞、炎性细胞和神经纤维，见图 1；非接触点鼻腔黏膜组织中NK-1R表达几乎未见，见图 2。对接触点和非接触点标本免疫反应结果进行秩和检验，差异有统计学意义(Z＝－4.625，P＝0.000)。见表 2。
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图1 NK-1R在接触点鼻腔黏膜组织中的表达(×400) Fig. 1 The expression of NK-1R in mucosal contact points(×400) |
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图2 NK-1R在非接触点鼻腔黏膜组织中未见明显表达(×400) Fig. 2 The expression of NK-1R in mucosal non-contact points (×400) |
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表2 接触点和非接触点NK-1R免疫组化结果比较[n＝18,n(%)] Tab. 2 Immunohistochemical results of NK-1R expression in mucosal contact points and non-contact point[n＝18,n(%)] |
从NK-1R免疫组化阳性的17例鼻黏膜组织标本中，随机选取5例接触点及对应的非接触点标本进行RT-PCR检测。结果显示，NK-1R、SP DNA溶解曲线为单峰，提示无非特异性扩增产物的存在。扩增曲线见图 3。5例接触点鼻黏膜组织中的NK-1R和SP mRNA表达水平均高于非接触点组织，见表 3。
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图3 扩增曲线 Fig. 3 Amplification curve in RT-PCR |
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表3 NK-1R及SP mRNA 在接触点组织中的表达RQ值(n＝18) Tab. 3 Relative quantitative expression of mRNA of SP and NK-1R in mucosal contact point (n＝18) |
黏膜接触点性头痛又称中鼻甲性头痛综合征，1980年由Morgenstein等[6]首次提出，2003年作为一种继发性头痛列入国际头痛分类标准-2[2]中，其病理基础为鼻腔解剖结构异常[3]。目前国内关于细胞因子在黏膜接触点性头痛中的作用鲜有报道。
孔令恒等[7]研究了NK-1R在大鼠心脏伤害性感受信息传递中的作用，提出NK-1R参与疼痛信息的传递。Shirasaki等[8]在人鼻腔的黏膜下腺体和气道上皮中检测到NK-1R的表达。此外NK-1R还存在于传导痛觉的C类纤维神经元(约50%)和Aδ类纤维(约20%)中。有研究表明，SP在鼻黏膜中有分布[9]，且SP 存在于某些初级传入纤维，其与外周伤害性刺激向中枢神经传递有关[4]。Blumenthal[10]等指出，黏膜接触点的机械压迫可能促使C类纤维末梢释放SP，而SP与NK-1R结合后可介导疼痛。
本实验发现，94.4%的接触点鼻黏膜组织内的NK-1R免疫组化结果为阳性；随机选取的5例接触点鼻黏膜组织内NK-1R和SP均过度表达，表明接触点鼻黏膜组织内高表达的NK-1R和SP的结合可能诱导了痛觉过敏，进而导致黏膜接触点性头痛的发生。其机制可能是SP 结合NK-1R后，激活细胞内第二信使磷酯酶C(PLC)，PLC导致细胞内三磷酸肌醇(IP3)和二酯甘油(DG) 浓度增加；而IP3可动员内质网内的Ca2＋，促使细胞内游离Ca2＋浓度增加，DG 则与Ca2＋一起激活蛋白激酶C(PKC)，促使NMDA受体磷酸化而提高其功能，对疼痛的传递起到易化作用[11]。既往研究表明，NK-1R与SP结合产生痛觉过敏，而NK-1R表达的缺失可抑制痛觉的产生[12]，这与本实验结果相似，但NK-1R介导疼痛的具体机制如何，有待进一步研究。
综上所述，接触点鼻黏膜组织内NK-1R的表达，可促进痛觉信号的传递，导致黏膜接触点性头痛的发生，SP可能是其传递疼痛信息的重要介质，这为未来临床治疗黏膜接触点性头痛提供了重要参考。
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