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  山东大学耳鼻喉眼学报  2016, Vol. 30 Issue (1): 9-13  DOI: 10.6040/j.issn.1673-3770.0.2015.490
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引用本文 

刘敏, 张大铮, 李昕蓉, 张富兵, 王晓培, 齐银辉, 张勤修. 穴位埋线调节变应性鼻炎大鼠鼻黏膜免疫微环境的研究[J]. 山东大学耳鼻喉眼学报, 2016, 30(1): 9-13. DOI: 10.6040/j.issn.1673-3770.0.2015.490.
LIU Min, ZHANG Dazheng, LI Xinrong, ZHANG Fubing, WANG Xiaopei, QI Yinhui, ZHANG Qinxiu. Catgut implantation at acupoints regulate immunity of sd rat with allergic rhinitis.[J]. Journal of Otolaryngology and Ophthalmology of Shandong University, 2016, 30(1): 9-13. DOI: 10.6040/j.issn.1673-3770.0.2015.490.

基金项目

国家自然基金( 81273985/H2902)

作者简介

刘敏。E-mail: liumin0109@126.com

通讯作者

张勤修。E-mail: zhqinxiu@163.com

文章历史

收稿日期:2015-11-18
网络出版时间:2016-01-10 16:06
穴位埋线调节变应性鼻炎大鼠鼻黏膜免疫微环境的研究
刘敏1 , 张大铮1, 李昕蓉2, 张富兵3, 王晓培2, 齐银辉4, 张勤修2     
1.都江堰市人民医院耳鼻咽喉科, 四川 都江堰 611830;
2. 成都中医药大学附属医院耳鼻咽喉科, 四川 成都 610075;
3. 乐山市中医医院耳鼻咽喉科, 四川 乐山 614000;
4. 甘肃省中医医院耳鼻咽喉科, 甘肃 兰州 730050
摘要: 目的 通过动物实验验证穴位埋线治疗变应性鼻炎(AR)的疗效,并从鼻黏膜免疫微环境方面探讨其作用机制。 方法 将70只健康SPF级SD大鼠随机分为空白组、AR模型组、AR西药组、AR穴位假埋线组、AR穴位埋线组。造模方法采用改进后的卵蛋白注射及其鼻黏膜刺激法。除空白组外各组予以不同治疗方法,治疗末日在卵白蛋白激发后,观察30 min,观察大鼠AR症状,记录并比较各组大鼠鼻部症状评分,之后立即处死动物,采集大鼠鼻中隔黏膜,采用免疫组化方法检测鼻黏膜组织 TGF-β1、IL-17的表达情况。结果 穴位埋线能明显缓解AR大鼠鼻部症状,如喷嚏、流涕、抓搔鼻部。与模型组比较,穴位埋线能降低鼻黏膜中TGF-β1、IL-17 含量。穴位假埋线也能降低AR大鼠鼻黏膜中TGF-β1含量。 结论 穴位埋线可降低AR大鼠鼻黏膜中TGF-β1、IL-17 含量,从而调节AR大鼠鼻黏膜免疫微环境。
关键词: 变应性鼻炎    穴位埋线    动物实验    免疫学    TGF-β1    IL-17    
Catgut implantation at acupoints regulate immunity of sd rat with allergic rhinitis.
LIU Min1 , ZHANG Dazheng1, LI Xinrong2, ZHANG Fubing3, WANG Xiaopei2, QI Yinhui4, ZHANG Qinxiu2     
1.Dujiangyan People's Hospital, Dujiangyan 611830, Sichuan, China;
2.Teaching Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, Sichuan, China;
3.Leshan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Leshan 614000, Sichuan, China;
4.Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730050, Gansu, China
Abstract: Objective To explore the effect of catgut implantation at acupoints on allergic rhinitis(AR) animals and to discuss the mechanism based on pathological morphology and immunology. Methods A total of 70 healthy SPF SD rats were randomly divided into the blank group, the AR model group, the AR western medicine group, the AR false catgut implantation at acupoint group and the AR catgut implantation at acupoint group. AR animal models were established according to the method of improved ovalbumin injection and nasal mucosa stimulation. Every group received different therapies except the blank group. After the last treatment day, ovalbumin nasal mucosa stimulation was carried out, then the symptoms were observed and recorded. SD rats were killed and septum mucosa was collected to detect expressions of tissue TGF-β1 and IL-17 by using immunohistochemical method. Results Catgut implantation at acupoints can obviously alleviate the symptoms of sneezing, runny nose and scratching of AR rats. Compared with model group(Ⅱ), catgut implantation at acupoints can reduce the TGF-β1 and IL-17 content in the AR rat nasal mucosa. False catgut implantation at acupoints can reduce the TGF-β1 content. Conclusion Catgut implantation at acupoints can reduce the TGF-β 1 and IL-17 content to regulate immune system in AR rat nasal mucosa, then alleviate AR rats symptoms.
Key words: Allergic rhinitis    Catgut implantation at acupoints    Animal experiment    Immunity    TGF-β1    IL-17    

变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是一种常见病、多发病,其发病率呈逐年增加趋势,全球发病率约10%~25%,我国2007年11个中心城市的流行病学调查显示成人患病率高达24.6%[1] 。大量临床实践证实,穴位埋线在治疗变应性鼻炎方面有一定的疗效,并可降低其复发率[2],结合目前变应性鼻炎发病机制的研究进展,本研究组推测穴位埋线可能影响变应性鼻炎患者鼻黏膜局部微环境中免疫细胞因子的变化,从而缓解症状,降低复发率。研究组从动物实验的角度观察了穴位埋线对AR大鼠鼻黏膜免疫指标的影响,提示穴位埋线在AR大鼠鼻黏膜免疫微环境方面具有免疫调节作用,报告如下。

1 材料与方法 1.1 实验动物 1.1.1 实验动物及其来源

SD大鼠70只,SPF级,3月龄,体质量180~220 g,雌雄各半。 大鼠来源:四川省成都达硕生物科技有限公司,许可证号:SCxk(川)2008-24 。

1.1.2 动物饲养环境及喂养

实验SD大鼠饲养于成都中医药大学眼科实验动物中心,实验分组前后均按性别分别关笼饲养。室内温度控制在20 ℃~25 ℃,湿度控制在50%~70%。采用定时定量喂养的方式,由专人负责喂养并保持环境清洁。

1.2 实验方法 1.2.1 分组

定时定量喂养1周后,由独立的统计学者使用SAS软件的PROC PLAN程序随机产生大鼠分组。共5组,每组14只(雌性7只,雄性7只):空白组、AR模型组、AR西药组、AR穴位假埋线组、AR穴位埋线组。

1.2.2 AR造模

参照我们通过预实验比较确定的最佳造模方式,即“卵白蛋白鼻腔强化激发法”[3]。1.治疗前造模:①基础致敏:OVA 1 mg+Al(OH)3 30 mg/NaCl 1 mL,五点注射(两侧腹股沟,两侧后足跖,腹腔)每处注射0.2 mL,第1天、第5天、第10天注射;②激发:从第16天起,鼻腔强化激发1次/d,1% OVA滴鼻,每侧鼻孔10 μL,30 min后1% OVA雾化吸入,30 min/次,共6 d。2.治疗干预阶段:于治疗干预后1 h给予1%卵白蛋白溶液局部半量激发,即大鼠双侧前鼻孔各滴入1%卵白蛋白溶液5 μL。

1.2.3 干预方法

造模结束后,即实验第22天后开始干预治疗。

1.2.3.1 AR西药组

造模成功后给予曲安奈德鼻喷雾剂进行滴鼻治疗,每次激发前1 h给药,每日1次共7 μg,每次每侧鼻孔1滴,每滴3.5 μg(约3.5 μL),双侧鼻孔给药,每周连续给药5 d后停止给药2 d,共4周。根据实验动物与人用药量的换算方法计算出用药剂量。根据单位体质量的计量来计算,大鼠的等效剂量相当于人的6.3倍,故算出大鼠每次每侧鼻腔滴鼻7 μg曲安奈德鼻喷雾剂(曲安奈德鼻喷雾剂用法用量:每次每侧鼻孔两喷,每喷为55 μg,每天1次,两鼻孔总量为220 μg。成人按照60 kg计算,约为3.7 μg/kg。)故大鼠曲安奈德鼻喷雾剂每日等效剂量为=6.3×3.7 μg/kg=23.1 μg/kg,每只大鼠大约0.3 kg,故每日用量 23.1 μg/kg×0.3 kg≈7 μg)。

1.2.3.2 穴位埋线治疗组

选穴:完成卵白蛋白对SD大鼠激发后,分两阶段行穴位埋线治疗。第一阶段为造模成功后1~2周,第二阶段为造模成功后3~4周,治疗时间共4周。第一阶段选择穴位为:百会穴、双侧肺俞穴;第二阶段选择穴位为:百会穴、双侧肺俞穴、双侧脾俞穴。穴位的选取依据为《实验针灸学》[19]及华兴邦等[4]研制的大鼠穴位图谱。取穴如下:肺俞:第三胸椎棘突下两旁肋间,直刺约5 mm。百会:顶骨正中。向前或后斜刺2 mm。脾俞:第12胸椎下两旁肋间。直刺约5 mm。

埋线:①消毒:穴位及周围皮肤用乙醇棉球消毒;②进针:选用9号埋线针,装上000号羊肠线,长度0.2~0.3 cm;③埋线:穴位埋线每2周1次,2次为1疗程。

1.2.3.3 AR穴位假埋线组

穴位选择及操作过程、疗程同穴位埋线治疗组,只是不埋入羊肠线。

1.2.3.4 空白组、AR模型组

治疗阶段开始时已取标本。

1.3 观察指标 1.3.1 一般情况

从造模第1天始,观察SD大鼠行为、摄食、饮水、大小便性状、皮毛、呼吸、精神、症状、体征等情况,着重观察大鼠鼻部症状,即:搔鼻、喷嚏、鼻溢等表现。

变应性鼻炎SD大鼠模型造模成功标准[5]:于最后一次滴鼻激发后观察大鼠30 min,即大鼠搔鼻、喷嚏、鼻溢等表现行为,以上各项指标均采用叠加量化记分法,总分>5分即表示AR大鼠造模成功(表 1)。积分方法:鼻痒:轻度瘙痒抓鼻1~2次记1分,剧烈瘙痒抓鼻四周记2分,全身四处搔抓记3分;喷嚏:1~3个记1分,4~10个记2分,11个以上记3分;清涕:清涕流至鼻孔记1分,超出前鼻孔记2分,流涕满面记3分。

表1 变应性鼻炎动物行为评分标准 Tab. 1 Behavioral scoring criteria of allergic rhinitis animals
1.3.2 检测指标

每组实验结束后,收集鼻黏膜组织标本进行实验室指标检测。每组按性别随机选择8只大鼠(4只雌性,4只雄性)进行指标检测(空白组、模型组于造模成功后处死大鼠采集标本,其余组于治疗4周后处死大鼠采集标本)。免疫组化方法检测鼻黏膜组织.由第三方检测组织对标本进行检测并提供数据。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0软件,计数资料采用χ2检验,计量资料以$\bar x \pm s$表示。组间比较采用单因素方差分析,若方差齐,组间差异进行LSD检验;若方差不齐,则进行Tamhane's T2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 一般资料

实验结束采集标本时,空白组14只,AR模型组14只,AR西药组12只、AR穴位假埋线组14只、穴位埋线组13只,共死亡3只大鼠。死亡情况如下:①AR西药组雄性大鼠20号:尸解考虑为脚趾感染导致全身败血症死亡;②AR穴位埋线组雄性大鼠62号:尸解考虑为埋线针刺穿左肺并发血气胸;③AR西药组雌性大鼠48号:大鼠死亡时鼻部见血迹,眼部出血,尸解考虑为感染性死亡。

2.2 症状评分

各组实验结束时变应性鼻炎症状评分见表 2

表2 末次鼻腔激发后各组大鼠症状得分比较($\bar x \pm s$) Tab. 2 Symptom score of each group after the last stimulation ($\bar x \pm s$)

症状评分分析提示:AR模型对照组与空白对照组比较,症状得分明显升高(P<0.05),提示造模成功。AR西药对照组、AR穴位假埋线组、AR穴位埋线组于治疗结束后,症状得分较模型对照组降低(P<0.05),并且AR西药对照组、AR穴位埋线组与空白对照组无统计学差异(P>0.05),提示西药、穴位埋线对AR大鼠有明显的治疗作用,但假埋线的治疗作用并不明显。AR西药对照组与AR穴位埋线组比较,得分无明显统计学差异(P>0.05),提示穴位埋线与西药对AR大鼠的治疗效果无明显差异。

假埋线对变应性鼻炎大鼠模型有一定的影响作用,但作用较穴位埋线差,提示穴位刺激对变应性鼻炎大鼠模型是有一定作用的,两组差异主要体现在有无羊肠线,可推测羊肠线对穴位的长期刺激在对变应性鼻炎大鼠模型的治疗中起重要作用。

2.3 治疗结束后各组AR大鼠模型鼻黏膜IL-17平均光密度值(integral optical density,IOD)比较 见表 3
表3 治疗结束后各组AR大鼠模型鼻黏膜IL-17免疫组化光密度值比较($\bar x \pm s$) Tab. 3 Integral optical density of nasal mucosa IL-17 at the end of the treatment in each group ($\bar x \pm s$)

AR模型对照组、AR穴位假埋线组较空白对照组AR大鼠鼻黏膜IL-17 IOD值显著升高(P<0.05),提示AR模型对照组、AR穴位假埋线组AR大鼠鼻黏膜IL-17高表达;AR西药组、AR穴位埋线组较AR模型对照组鼻黏膜IL-17 IOD值显著降低(P<0.05),提示西药及穴位埋线能显著降低变应性鼻炎大鼠鼻黏膜IL-17的表达。AR穴位假埋线组与AR模型对照组比较,鼻黏膜IL-17 IOD值无统计学意义(P>0.05),提示假埋线对变应性鼻炎大鼠鼻黏膜IL-17的表达无明显影响。AR西药组与AR穴位埋线组比较鼻黏膜IL-17 IOD值无统计学意义(P>0.05),提示西药与穴位埋线对变应性鼻炎大鼠鼻黏膜IL-17表达的影响无明显差异。

2.4 治疗结束后各组AR大鼠模型鼻黏膜TGF-β1免疫组化光密度值比较 见表 4
表4 治疗结束后各组AR大鼠模型鼻黏膜TGF-β1免疫组化光密度值比较($\bar x \pm s$) Tab. 4 Integral optical density of nasal mucosa TGF-β1 at the end of the treatment in each group($\bar x \pm s$)

AR模型对照组、AR穴位假埋线组较空白对照组大鼠鼻黏膜TGF-β1 IOD值显著升高(P<0.05),提示AR模型对照组、AR穴位假埋线组大鼠鼻黏膜TGF-β1高表达;AR西药组、AR穴位埋线组、AR穴位假埋线组较AR模型对照组大鼠鼻黏膜TGF-β1 IOD值显著降低(P<0.05),提示AR西药、AR穴位埋线、AR穴位假埋线能显著降低变应性鼻炎大鼠鼻黏膜TGF-β1表达。AR西药组与AR穴位埋线组比较,AR大鼠鼻黏膜TGF-β1 IOD值无统计学意义(P>0.05),提示西药与穴位埋线对变应性鼻炎大鼠鼻黏膜TGF-β1表达的影响无明显差异。

3 讨 论

针灸是中医独具特色的治疗技术,在调节免疫方面具有双向作用。穴位埋线疗法属于穴位埋藏疗法之一[6],是一种新型的针灸方法,它是根据针灸理论与现代物理医学相结合的产物,它通过针具与羊肠线在穴位产生的生理物理作用和生物化学变化,将其刺激信息和能量经经络传入人体内,以达“疏其气血,令其条达”,治疗疾病的目的。

本病多由机体正气不足,脏腑功能虚衰,以致腠理疏松,卫表不固,风邪、寒邪或异气侵袭而发病。临床辨证分型以虚证为主,尤其是肺脾气虚多见,治疗上多采用补气固表、健脾益胃、升阳益气的方法。故我们主要基于两个方面选取治疗穴位:①变应性鼻炎的病因病机及鼻与经络的关系,以保证疗效;②结合SD大鼠穴位分布特点及穴位埋线自身对穴位的要求,以保证实施治疗的可行性。最终我们选择双侧肺俞穴、双侧脾俞穴、百会穴进行穴位埋线。

Th17细胞是一类新的T细胞亚群,它的发现源于学者“Park”对两种自身免疫性疾病的动物模型(EAE和CIA)的研究探知[7],它属于CD4+T细胞。IL-17是Th17的特征性细胞因子,属于一种前炎症性细胞因子,在AR炎症反应过程中黏膜组织水肿,黏液腺分泌大量黏液,在临床中则表现为鼻塞、流清涕;其次IL-17还能增加气道的高反应性,这严重影响着气道慢性炎症性疾病的发生发展[8]。很多证据证明,IL-17的异常表达与多种变态反应性疾病相关,而且IL-17可诱导组织表达多种促炎因子、趋化因子,加重局部炎症反应[9]。IL-17在变应性鼻炎中的免疫炎症作用具有类似的机制。IL-17能够促进多种细胞释放炎性因子,继而促使黏液腺分泌大量黏液,增加人体气道的高反应性,这与气道慢性炎症性疾病的发生发展有着密切关系[10]

本研究表明,变应性鼻炎大鼠鼻黏膜组织中IL-17高表达,反映了AR免疫炎症性疾病的特征。曲安奈德喷鼻剂和穴位埋线均能减少变应性鼻炎大鼠鼻黏膜中IL-17的含量,这证明了穴位埋线可从降低IL-17的途径减少炎性因子的释放,降低气道高反应,从而缓解变应性鼻炎症状。

TGF-β来源于诱生型Treg细胞,而在只有TGF-β存在时,初始T细胞被诱导转化为Treg细胞,TGF-β和IL-6共同存在时,初始T细胞则被诱导转化为Th17细胞,这表明,通过TGF-β,建立起了Thl7细胞与Treg细胞之间复杂的相关关系。 TGF-β1是TGF-β的一个亚型,主要由上皮细胞、嗜酸性细胞、Th2 淋巴细胞、巨嗜细胞及成纤维细胞等产生,并黏附于气道黏膜上皮下细胞外基质中[11]。该细胞因子本身是一个多功能分子,在调节炎症免疫应答方面起着重要作用[12],特别是在炎症和组织修复等方面都具有重要的调节作用[13]

在变应性鼻炎病理机制中,TGF-β具有非常重要的生物学效应。变应性鼻炎小鼠及变应性鼻炎患者鼻黏膜内有活化的TGF-β信号转导,可能与杯状细胞的增生有关[14],这说明鼻黏膜分泌物增加与TGF-β有一定的关系。有学者推测Treg细胞可能通过所分泌的IL-10和TGF-β,抑制IL-4等Th2关键性细胞因子的产生,进而减少IgE 的生成[15];而TGF-β还可抑制嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞的致炎作用,从而抑制变态反应性炎症的发生和发展。其次,TGF-β在促炎化中的作用也非常明显,TGF-β可刺激纤维母细胞合成和分泌胶原,促进纤维母细胞向肌纤维母细胞(此细胞合成胶原能力更强),这在气道重塑的过程中起着非常重要的作用[16, 17]

在AR鼻腔黏膜组织重塑过程中,TGF-β同样起到了重要作用。刘争等[18]发现,TGF-β1 在AR患者鼻黏膜中显著高表达,推测TGF-β1可能参与了AR的组织结构重塑。同时,有动物实验显示[12],在AR豚鼠鼻黏膜上皮细胞和黏膜固有层内浸润的炎性细胞胞浆和细胞外基质中,细胞因子 TGF-β1明显表达,而非AR豚鼠的鼻黏膜中几乎没有TGF-β1的表达,这也提示TGF-β1可能在AR鼻黏膜重塑的过程中起重要作用。

本实验发现,变应性鼻炎大鼠造模成功后,大鼠鼻黏膜组织中TGF-β1明显升高,说明在AR炎症反应中TGF-β1起着重要的作用。采用曲安奈德鼻喷剂及穴位埋线治疗后,TGF-β1均下降,与模型组比较差异有统计学意义,为了观察地塞米松对 TGF-β1 表达的影响,AR鼠类实验动物模型制备成功后,予以地塞米松干预,结果提示地塞米松能有效抑制AR鼠类动物模型中 TGF-β1的表达,表明鼻用激素及穴位埋线均能降低鼻黏膜中TGF-β1的含量,从而调节鼻黏膜局部免疫微环境,控制变应性大鼠鼻黏膜变态反应性炎症及缓解其组织重塑继续发展。由实验结果可知,穴位假埋线也能降低AR大鼠鼻黏膜中TGF-β1含量,说明单纯穴位刺激也能在一定程度上对AR大鼠鼻黏膜免疫平衡产生一定的影响,具体机制有待进一步研究。

研究发现,穴位假埋线能降低变应性鼻炎大鼠鼻黏膜中TGF-β1的含量,说明单纯穴位刺激对AR大鼠鼻黏膜免疫环境也有一定的影响。穴位假埋线对其他指标也有一定的调节趋势,但无统计学意义,推测其原因可能是穴位假埋线组中未将羊肠线植入穴位,对穴位未起到长时间刺激的作用。反之穴位埋线组植入羊肠线后,对穴位起到长期刺激的作用,进而缓慢调节免疫系统。这在一定程度上说明了穴位埋线治疗变应性鼻炎的机制应分为单纯的短期穴位刺激和羊肠线吸收的长期穴位刺激两个部分,其具体机制还需进一步研究。

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