50%以上的耳聋属于遗传性耳聋，其中70%属于非综合征型耳聋，仅有耳聋表现，无其它临床症状^[1]；30%属于综合征型耳聋，除耳聋以外尚伴有其它临床症状。2006年中国第二次残疾人抽样调查数据^[2]表明，单纯听力残疾人已达2004万，并以每年3万左右的速度递增。然而，中国人口众多，不同地区或民族遗传背景差异较大，全国聋病分子流行病学研究数据^[3]显示，各种基因突变位点具有明显的地域特征，只有明确各地区耳聋基因的分子流行病学特点，才能高效地在全国范围内特异性开展并实施耳聋基因检测工作。目前，关于山东地区耳聋人群致病基因突变的报道极少，或样本量较少，或受筛查方法所限，尚无明确的指导性数据供参考。因此，本研究应用操作简便快速、特异准确、筛查范围广的十四项遗传性耳聋基因突变检测试剂盒对山东地区非综合征型耳聋人群进行耳聋基因突变位点检测，旨在发现本地区耳聋基因相关的热点突变，弥补山东地区耳聋基因分子流行病学方面的不足，为进一步指导耳聋基因筛查项目提供依据。

845例耳聋患者分别来自山东济南、济宁、泰安、滨州等地区的聋人学校，经病史询问、纯音测听或ABR检测等确诊为非综合征型耳聋，排除可能引起耳聋的综合症，排除标准：①老年性耳聋；②有长期酗酒史；③患有精神性疾病者、智力障碍；④3个月内参加过临床试验者；⑤外耳、中耳病变引起的传导性耳聋；⑥环境因素致聋。其中男568例，女279例；3～60岁，平均24岁；极重度聋372例，重度聋403例，中度聋70例；回族1例，其余为汉族。351例经健康体检听力正常且均无听力损失家族史者为对照，其中男175例，女176例；3～60岁，平均25岁；全部汉族。受试者均签署知情同意书，或由亲属代签，本研究获得山东大学齐鲁医院、山东大学第二医院、山东中医药大学附属医院伦理委员会批准。

采用济南英盛生物技术有限公司自主研发的十四项遗传性耳聋基因检测试剂盒(包括先天性耳聋基因检测试剂盒、迟发性耳聋基因检测试剂盒、药物性耳聋基因检测试剂盒。先天性耳聋基因检测试剂盒可测试八个位点：GJB2基因235delC、299_300delAT、176_191del16、35delG、155delTCTG、512insAACG；GJB3基因538C＞T、547G＞A。迟发性耳聋基因检测试剂盒可测试四个位点：SLC26A4基因IVS7-2A＞G、2168A＞G、1174A＞T、1229C＞T。药物性耳聋基因检测试剂盒可测试两个位点：mtDNA 12S rRNA基因A1555G、C1494T。)进行样本DNA提取和十四个位点测试，DNA制备、反应液分装、加样、上机测试完全按照说明书进行，本研究所用PCR仪器为ABI7500[美国]。检测原理：采用探针特异性PCR技术，分别针对目的基因序列设计高度特异的引物及探针，探针与引物扩增区段特异性结合，在PCR延伸过程中，DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性将5′报告荧光基团切除，使其与淬灭荧光基团分离，从而发出特定波长的荧光信号。根据检测到的荧光信号类型，即可判断是否存在相应位点突变。

共检测到GJB2基因突变197例，其中纯合突变70例、复合杂合突变33例、单杂合突变94例。GJB2基因235delC位点纯合突变66例，杂合突变95例(图 1)，阳性检出率为19.1%(161/845)，复合杂合突变占杂合突变33.7%(32/95)；GJB2基因299_300delAT位点纯合突变3例，杂合突变54例，阳性检出率为6.7%(57/845)，复合杂合突变占杂合突变51.9%(28/54)；GJB2基因176_191del16位点纯合突变1例，杂合突变7例，阳性检出率为0.9%(8/845)，复合杂合突变占杂合突变42.9%(3/7)；GJB2基因512insAACG位点纯合突变0例，杂合突变4例，阳性检出率为0.5%(4/845)，复合杂合突变占杂合突变75.0%(3/4)；GJB2基因35 delG、155delTCTG位点未发现突变。详见表 1、表 2。共检测到GJB3基因突变1例，为538C>T位点杂合突变，未发现547G>A位点突变。

图 1

图 1 35delC位点扩增曲线图 Figure 1 Amplification curve of 235delC site

表 1

表 1 845例非综合征型耳聋患者GJB2基因突变情况 Table 1 GJB2 gene mutations of 845 cases of patients with non-syndromic hearing loss 突变位点 杂合突变 人数 纯合突变 人数 阳性检出率 235delC 95 66 19.1%(161/845) 299_300delAT 54 3 6.7%(57/845) 176_191del16 7 1 0.9%(8/845) 35delG 0 0 0 (0/845) 155delTCTG 0 0 0 (0/845) 512insAACG 4 0 0.5%(4/845)

表 1 845例非综合征型耳聋患者GJB2基因突变情况 Table 1 GJB2 gene mutations of 845 cases of patients with non-syndromic hearing loss

表 2

表 2 GJB2基因复合杂合突变情况 Table 2 Compound heterozygous mutations of GJB2 gene 等位基因1 等位基因2 患者人数 235delC 299_300delAT 27 235delC 176_191del16 3 235delC 512insAACG 2 299_300delAT 512insAACG 1

表 2 GJB2基因复合杂合突变情况 Table 2 Compound heterozygous mutations of GJB2 gene

GJB2基因235delC位点突变携带者5例、GJB2基因299_300delAT位点突变携带者3例，携带率分别为1.4%(5/351)、0.9%(3/351)。

共检测到SLC26A4基因突变142例，其中纯合突变23例、复合杂合突变16例、单杂合突变103例。SLC26A4基因IVS7-2A＞G位点纯合突变19例，杂合突变90例(图 2)，阳性检出率为12.9%(109/845)，复合杂合突变占杂合突变16.7%(15/90)；SLC26A4基因2168A＞G突变3例，杂合突变29例，阳性检出率为3.8%(32/845)，复合杂合突变占杂合突变44.8%(13/29)；SLC26A4基因1174A＞T突变0例，杂合突变12例，阳性检出率为1.4%(12/845)，复合杂合突变占杂合突变41.7%(5/12)；SLC26A4基因1229C＞T位点纯合突变1例，杂合突变5例，阳性检出率为0.7%(6/845)，复合杂合突变0例。详见表 3、表 4。

图 2

图 2 IVS7-2A＞G位点扩增曲线 Figure 2 Amplification curve of IVS7-2A＞G site

表 3

表 3 845例非综合征型耳聋患者SLC26A4基因突变情况 Table 3 SLC26A4 gene mutations of 845 cases of patients with non-syndromic hearing loss 突变位点 杂合突变 人数 纯合突变 人数 阳性检出率 IVS7-2A>G 90 19 12.9%(109/845) 2168A>G 29 3 3.8%(32/845) 1174A>T 12 0 1.4%(12/845) 1229C>T 5 1 0.7%(6/845)

表 3 845例非综合征型耳聋患者SLC26A4基因突变情况 Table 3 SLC26A4 gene mutations of 845 cases of patients with non-syndromic hearing loss

表 4

表 4 SLC26A4基因复合杂合突变情况 Table 4 Compound heterozygous mutations of SLC26A4 gene 等位基因1 等位基因2 患者人数 IVS7-2A>G 2168A>G 11 IVS7-2A>G 1174A>T 3 IVS7-2A>G、2168A>G 1174A>T 1 2168A>G 1174A>T 1

表 4 SLC26A4基因复合杂合突变情况 Table 4 Compound heterozygous mutations of SLC26A4 gene

SLC26A4基因IVS7-2A＞G位点突变携带者4例、SLC26A4基因2168A＞G位点突变携带者2例，携带率分别为1.1%(4/351)、0.6%(2/351)。

共检测到mtDNA 12S rRNA基因突变34例，其中mtDNA 12S rRNA基因A1555G位点均质突变33例(图 3)，mtDNA 12S rRNA基因C1494T位点均质突变1例，阳性检测率分别为3.9%(33/845)、0.1%(1/845)。详见表 5。

图 3

图 3 A1555G位点扩增曲线 Figure 3 Amplification curve of A1555G site

表 5

表 5 845例非综合征型耳聋患者mtDNA 12S rRNA基因突变情况 Table 5 mtDNA 12S rRNA gene mutations of 845cases of patients with non-syndromic hearing loss 突变位点 异质突变人数 均质突变人数 阳性检出率 A1555G 0 33 3.9%(33/845) C1494T 0 1 0.1%(1/845)

表 5 845例非综合征型耳聋患者mtDNA 12S rRNA基因突变情况 Table 5 mtDNA 12S rRNA gene mutations of 845cases of patients with non-syndromic hearing loss

mtDNA 12S rRNA基因无A1555G、C1494T位点突变。

我国新生儿听力筛查资料^[4]显示,新生儿中听力损失检出率为2‰~6‰。随着人们优生优育及孕期保健意识的提高，环境因素致聋的因素逐渐降低，遗传性耳聋所占比例逐渐增高，因此，耳聋基因突变检测日益重要，耳聋基因突变的分子流行病学数据可有效指导临床工作。由于不同地区、不同种族遗传背景存在差异，耳聋基因致病类型及频率存在明显地域特征，了解各省份常见耳聋基因突变特点，才能有效实施耳聋基因项目检测及筛查工作。本研究运用快速准确方便的耳聋基因突变诊断方法，探讨了山东地区耳聋基因突变的分子流行病学特征，为加快本地区耳聋基因检测与筛查项目提供依据。

目前已发现的非综合征型耳聋基因有100个左右(http://hereditaryhearingloss.org)，研究^[5]发现GJB2、SLC26A4、mtDNA 12S rRNA是导致非综合征型耳聋的常见致病基因。

GJB2基因编码间隙连接蛋白26，在人体内大多数组织内均有分布，发生突变后，导致内耳K⁺循环紊乱，影响信使分子传递，从而表现为听觉异常。GJB2基因突变患者出生时就已存在耳聋，但若及时发现，植入人工耳蜗，通过言语学习，可避免聋哑残疾。目前研究数据表明，在亚洲人群中，235delC是GJB2基因上最常见的突变位点^[6-7]，而白种人GJB2基因上的热点突变是35delG^[8]，犹太人则是167delT位点^[9]，可见，种族间的热点突变类型具有特异性。据报道，在全国18个不同省市(不包括山东省)的1 190例非综合征型耳聋患者中，GJB2基因上235delC、299_300delAT、176_191del16的阳性检出率分别为18.66%、5.21%、1.60%^[10]；在全国23个不同省市(不包括山东省)的2063例非综合征型耳聋患者中，GJB2基因上235delC、299_300delAT、176_191del16、35delG、155delTCTG、512insAACG的阳性检出率分别为16.7%、4.36%、1.4%、0.58%、0.15%、0.58%^[11]。而本次研究中针对山东地区的非综合征型耳聋患者，GJB2基因235delC、299_300delAT、176_191del16、35delG、155delTCTG、512insAACG的阳性检出率分别为19.1%、6.7% 、0.9%、0、0、0.5%，以235delC位点的致病率最高，其次为299_300delAT位点，热点突变类型与上述文献报道相同，即235delC、299_300delAT是山东地区GJB2基因上的主要致病位点，但突变频率稍高于全国平均水平，235delC、299_300delAT的杂合突变者中存在50%左右的复合杂合突变，可见这两个位点多伴有另一个突变位点，协同致聋；而GJB2基因176_191del16、512insAACG位点的突变频率相对偏低，且以复合杂合的形式存在为主；但未发现GJB2基因35delG、155delTCTG位点突变病例。正常听力人群中也存在一定比例的GJB2基因235delC或299_300delAT携带者，针对这些人群必须进行婚配或生育指导，避免后代出现聋儿。可见，GJB2基因235delC、299_300delAT位点可作为山东地区耳聋基因筛查工作中的重点检测项目，而GJB2基因176_191del16、512insAACG位点也可列入常规检测项，避免盲目筛查。

GJB3基因编码连接蛋白31，是间隙连接蛋白家族的主要成员，主要导致人类神经性高频听力下降，1998年由我国夏家辉院士首先克隆。目前，报道相对较多的致病位点是GJB3基因538C＞T无义突变和547G＞A错义突变。本研究中，仅发现1例538C＞T杂合突变者，可见，GJB3基因538C＞T、547G＞A并不是山东地区耳聋基因筛查的主要突变位点。

SLC26A4基因突变与前庭水管扩大(enlarged vestibular aqueduct,EVA)及Pendred综合征密切相关，也是目前被认定的唯一与EVA有关的基因，属于常染色体隐性遗传^[12],含21个外显子，开放阅读框架2 343 bp，编码阴离子转运体跨膜蛋白Pendrin，主要与氯-碘离子的转运有关^[13]。大前庭水管综合征是一种内耳疾病，在儿童和青少年中较为常见，在临床上俗称“一巴掌致聋”，主要表现为出生时多听力正常，但在成长过程中在感冒、头外伤、剧烈运动等诱发因素的刺激下，可发展成重度耳聋甚至全聋。针对大前庭水管综合征具有迟发性听力下降的特点，通过对SLC26A4基因常见突变位点检测，采取有效预防措施可避免和延缓耳聋的发生。在SLC26A4基因的所有突变位点中，IVS7-2A＞G是中国人群突变发生率最高的位点，约占81.6%^[14]，其次为2168A＞G位点，两个位点常以复合杂合突变形式联合致聋。据报道^[15]，在来自中国27个城市(不包括山东省)的2 352个非综合征型耳聋患者中，SLC26A4基因IVS7-2A＞G、2168A＞G、1174A＞T、1229C＞T四个已知致病位点的阳性检出率分别为11.52%、2.5%、0.55%、0.51%，以IVS7-2A＞G位点为首，突变频率明显高于其余三个位点。而本次研究中这四个位点的阳性检出率分别为12.9%、3.8%、1.4%、0.7%，与上述报道相比，各位点突变趋势相当，但1174 A＞T位点在山东地区具有较高检出率，可能与遗传背景不同相关，而且1174 A＞T位点主要与IVS7-2A＞G或2168 A＞G复合杂合突变形式存在为主，但1229C＞T位点在本研究中未发现这种现象，SLC26A4基因存在21个外显子，所以它的致病位点也是非常复杂的，可能还存在其它未发现的突变位点。正常听力人群中，SLC26A4基因IVS7-2A＞G、2168A＞G两个位点具有较高携带率，可作为临床筛查高危人群的热点突变。通过对高危人群进行针对性的指导婚配，避免出现聋儿。可见，IVS7-2A＞G、2168A＞G位点是山东地区SLC26A4基因突变患者中的热点突变，同时，SLC26A4基因1174A＞T、1229C＞T位点也以一定比例出现，共同影响山东地区大前庭水管患者听力健康。

mtDNA 12S rRNA基因，是另一个导致非综合征型耳聋的致病基因，位于细胞质中，具有母系遗传的特点，与氨基糖苷类抗生素的使用有重要关联。mtDNA A1555G是其基因上最常见的突变位点，碱基的突变造成该部位空间构象改变，成为氨基糖苷类药物攻击的靶目标，影响核糖体蛋白氧化磷酸化过程，ATP合成受阻，造成内耳毛细胞两侧离子浓度失衡，细胞受损死亡，导致药物性耳聋的发生甚至一针致聋。这部分患者出生时听力一般都正常，但在服用了氨基糖苷类抗生素后，因个体差异出现不同程度的听力损失，且随用药剂量增加可加剧耳聋，儿童用药一次就可导致重度聋或全聋^[16]。由于此类患者对于氨基糖苷类药物非常敏感，所以若进行基因检测，发现携带这种致病基因，避免氨基糖苷类药物的使用，则可避免耳聋的发生。流行病学调查数据表明，mtDNA A1555G和C1494T是我国耳聋人群mtDNA 12S rRNA基因上存在的两个主要致病位点，携带率分别为3.34%、0.45%^[17]。而本次研究中，mtDNA 12S rRNA基因A1555G和C1494T两个位点的阳性检出率分别为3.9%、0.1%，A1555G位点检出水平比全国平均水平高0.56%，而C1494T位点检出水平比全国平均水平低0.35%，这是由研究对象数量不同和地域、种族差异导致的遗传背景不同造成的。由此可见，在山东省非综合征型耳聋人群中，对于药物性耳聋患者，以A1555G位点突变更常见。

综上所述，对于山东地区的非综合征型耳聋患者，其热点突变类型具有地域特异性，具体表现方式为与先天性耳聋相关的突变以GJB2基因235delC、299_300delAT位点为主，与已有文献报道相同^[18]，且在正常人群中也有较高携带率，其余依次为GJB2基因176_191del16、512insAACG，而GJB2基因35delG、155delTCTG、538C＞T、547G＞A位点较少见；与迟发性耳聋相关的突变以SLC26A4基因IVS7-2A＞G、2168 A＞G位点为主，同样这两个位点在正常人群中也有较高携带率，其余依次为SLC26A4基因1174A＞T、1229C＞T，且这两个位点有较高检出水平；与药物性耳聋相关的突变以mtDNA 12S rRNA基因A1555G位点为主，本次研究中虽然仅发现1例C1494T位点突变病例，但由于药物性可导致一针致聋的严重后果，所以建议将mtDNA 12S rRNA基因A1555G和C1494T两位点均纳入检测耳聋基因筛查项目中。

此外，本次研究所用的英盛十四项遗传性耳聋基因检测试剂盒筛查准确快速，操作简便，且每个位点检测结果互不干扰，根据本地区耳聋位点的突变情况，可自由选择需要进行筛查的位点，避免盲目筛查，从而减少额外花费。山东省是人口大省，根据2006年第二次残疾人口调查数据显示，山东省听力残疾人约有150万，每年新生聋儿超过1500人，国家对这一状况非常重视及关注，在2014年3月3日山东省被中国残联确定为全国第一个听力残疾遗传干预试点。可见，山东地区的遗传性耳聋基因筛查工作势在必行，对于不同的耳聋人群要制定适宜的筛查策略，将本地区耳聋流行病学数据与适合的诊断方法有力结合，必能有效指导本地区耳聋工作的顺利开展，从根本上降低出生缺陷，减少社会和家庭负担。

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