山东大学耳鼻喉眼学报  2016, Vol. 30 Issue (3): 24-28  DOI: 10.6040/j.issn.1673-3770.0.2015.340
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引用本文 

胡文良, 郑艳秋, 崔晓波, 崔彦茹, 孙源昊. 下咽癌中差异表达的蛋白激酶及其抑制剂的生物信息学筛选[J]. 山东大学耳鼻喉眼学报, 2016, 30(3): 24-28.DOI: 10.6040/j.issn.1673-3770.0.2015.340.
HU Wenliang , ZHENG Yanqiu , CUI Xiaobo , CUI Yanru , SUN Yuanhao . Bioinformatic screening of differentially expressed protein kinases and their inhibitors in hypopharyngeal cancer[J]. Journal of Otolaryngology and Ophthalmology of Shandong University, 2016, 30(3): 24-28. DOI: 10.6040/j.issn.1673-3770.0.2015.340.

基金项目

内蒙古自治区自然科学基金(2014MS0856)；内蒙古医科大学科技百万工程项目(KJbw2013014)

作者简介

胡文良。 E-mail：huwenliangnmg@126.com。

通讯作者

郑艳秋。 E-mail：zhengyanqiu2001@163.com

文章历史

收稿日期：2015-08-15
网络出版时间：2016-03-31
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下咽癌中差异表达的蛋白激酶及其抑制剂的生物信息学筛选
胡文良, 郑艳秋, 崔晓波, 崔彦茹, 孙源昊     
内蒙古医科大学附属医院耳鼻咽喉科， 内蒙古 呼和浩特 010050
收稿日期：2015-08-15 ；网络出版时间：2016-03-31
基金项目：内蒙古自治区自然科学基金(2014MS0856)；内蒙古医科大学科技百万工程项目(KJbw2013014)
作者简介：胡文良。 E-mail：huwenliangnmg@126.com。
通讯作者：郑艳秋。 E-mail：zhengyanqiu2001@163.com
摘要: 目的 筛选下咽癌中差异表达的激酶基因及其选择性抑制剂，为下咽癌的分子靶向治疗提供新的参考。 方法 利用GEO数据库和SAM软件筛选下咽癌中差异表达的激酶基因，体外培养人下咽癌FaDu细胞系。为验证GEO数据库中芯片结果的准确性，利用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测差异表达激酶在FaDu细胞中的表达量，通过KEGG数据库获得激酶调控的通路，利用激酶抑制剂数据库和文献挖掘筛选获得在下咽癌FaDu细胞系中差异表达激酶的选择性抑制剂。 结果 ①在GEO数据库的下咽癌基因组表达谱中，共筛选出3个高表达的激酶基因，分别为PKC-β、CDK6和CDC42(差异倍数≥2.0且P <0.05)；②Real-time PCR结果显示在人下咽癌FaDu细胞中这3个上调激酶基因也出现高表达(P <0.05)，证明全基因组的结果准确；③KEGG通路分析的结果显示3个高表达激酶调控复杂的通路网络；④激酶抑制剂的筛选结果显示共有5个激酶抑制剂调控PKC-β， 4个激酶抑制剂调控CDK6，3个激酶抑制剂调控CDC42。文献挖掘的结果显示在这12个激酶抑制剂中，有4个在癌症方面的研究较少，文献 <10篇。 结论 下咽癌中共有3个激酶PKC-β、CDK6和CDC42发生高表达，并发挥促癌作用。它们的激酶抑制剂可能有潜在的抗癌作用，为下咽癌的分子治疗提供新的切入点。
关键词: 下咽癌    蛋白激酶    激酶抑制剂    生物信息学    
Bioinformatic screening of differentially expressed protein kinases and their inhibitors in hypopharyngeal cancer
HU Wenliang, ZHENG Yanqiu, CUI Xiaobo, CUI Yanru, SUN Yuanhao     
Department of Otolaryngology, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, Inner Mongolia, China
Abstract: Objective To screen differentially expressed protein kinases and their inhibitors, in order to provide new targets for molecular therapy of hypopharyngeal cancer. Methods GEO database and SAM software were employed to screen the differentially expressed protein kinase genes in hypopharyngeal cancer. Human hypopharyngeal cancer FaDu cell line was cultured in vitro. Real-time PCR was used to prove the accuracy of microarray results. Based on KEGG database, the kinase-regulated pathways were identified. The inhibitors of such kinases were identified by using kinase-inhibitor database. Results A total of 3 protein kinase genes (PKC-β, CDK6 and CDC42) were identified (fold change≥2.0, P <0.05). Real-time PCR showed that the 3 kinase genes were differentially expressed in FaDu cells, which was consistent with the microarray results (P <0.05) Pathway analysis indicated that a complex pathway network was regulated by the 3 kinases. The results of inhibitor screening showed that 5 inhibitors regulated PKC-β, 4 inhibitors regulated CDK6 and 3 inhibitors regulated CDC42. There were less than 10 studies about the 4 inhibitors in cancer. Conclusion Three differentially expressed protein kinases (PKC-β, CDK6 and CDC42) are identified and they are able to promote the development of tumor. Their kinase inhibitors may play a potential anti-cancer role, which may provide a new target for molecular therapy of hypopharyngeal cancer.
Key words: Hypopharyngeal cancer    Protein kinase    Kinase inhibitor    Bioinformatics    

下咽癌占下咽原发恶性肿瘤的95%，其主要治疗手段为手术和放疗，但因其发生部位隐蔽，恶性程度高，约50%的患者在确诊时已存在淋巴结转移， 预后较差[1-3]。手术治疗也很大程度会影响患者发声功能给身心带来重创,因此寻找创伤小、不良反应少的治疗新手段十分必要。现有研究表明[4]，蛋白激酶与肿瘤发生发展关系密切，蛋白激酶抑制剂作为分子靶向抗癌治疗中的常见药物，也已取得良好的治疗效果。2015年2月至2015年5月我们研究利用生物信息学方法筛选下咽癌中高表达的激酶基因，并结合激酶-抑制剂网站筛选这些高表达激酶的激酶抑制剂，为下咽癌的分子靶向治疗提供新的切入点。

1 材料与方法 1.1 主要材料

人下咽癌细胞系FaDu，由本实验室保存；DMEM，胎牛血清(Hyclone公司，美国)；RNA总提取试剂Trizol(Invitrogen公司，美国)；PCR试剂盒(Roche公司，美国)。

1.2 方法 1.2.1 下咽癌组织中高表达激酶基因的筛选

在GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)中获得34例下咽癌样本的全基因组表达谱芯片结果(编号：GSE2379)。利用SAM(Significance Analysis of Mciroarrays)软件(http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/)对全部基因进行差异表达分析，FDR控制在0.1以下。利用激酶库信息，在差异表达的基因中筛选出高表达的激酶基因。

1.2.2 细胞培养

从液氮中取出人下咽癌FaDu细胞后，迅速解冻，离心去上层清液。置于含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基中，于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养，每2天换液一次。

1.2.3 高表达激酶表达量的实时定量

聚合酶链(Real-time PCR)验证培养生长状态良好的FaDu细胞，48 h后将目的细胞分入6孔板培养，采用Real Time-PCR的方法检测差异激酶基因的表达情况。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行总RNA抽提。根据M-MLV操作说明书进行RNA逆转录获得cDNA。PKC-β基因引物序列上游引物：5′-GATGGCTGACCCGGCTGCG-3′；下游引物：5′-CGCAGCCGG GTCAGCATC-3′； CDK6基因引物序列上游引物：5′-GAAGCAGTGTGG AAATTAGGTGACGGGACACAGTCTTATA-3′；下游引物：5′-TATAAGACTGTGTCCCGTCAC CTAATTTCCAC-ACTGCTTC-3′；CDC42基因引物序列上游引物：5′-TATGATTGGTGGAGAACCAT-3′；下游引物：5′-ATTCTTTAGGCCTTTCTGTG-3′；GAPDH基因引物序列上游引物：5′-TGCTCCAACTCCTCCTCAG-3′；下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′；预变性95 ℃，15 s；之后每一步变性95 ℃，5 s；退火延伸60 ℃，30 s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。制作溶解曲线。分析差异表达激酶基因在下咽癌FaDu细胞系中的表达情况，正常人咽上皮NP69细胞系作为对照组。

1.2.4 高表达蛋白激酶的通路(pathway)分析

将下咽癌样本中高表达的蛋白激酶基因输入KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.kegg.jp)数据库，得到差异激酶所调控的通路。利用Cytoscape 2.8.2 软件(http://www.cytoscape.org/)绘制激酶-通路网络图。

1.2.5 激酶抑制剂的筛选

利用激酶-抑制剂-图书馆数据库(http://www.selleckchem.com/?fileName=Selleck-Kinase-Inhibitor-Library.xlsx)筛选出目的激酶的抑制剂。再利用文献挖掘技术(Thomson Data Analyzer软件,http://thomsonreuters.com/thomson-data-analyzer/)，在Pubmed数据库中以“癌症”和“激酶抑制剂”为关键词，筛选出目的激酶抑制剂在癌症研究方面的文献数量，以预测潜在的下咽癌治疗新药物。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行独立样本t检验，差异基因包括激酶基因的筛选采用多重检验，Real-time PCR数据各分组所得计量数据采用x±s表示，P <0.05为差异有统计学意义。[注：统计学内容部分由香港中文大学贾婿研究员帮助审查(E-mail:jiaxu2006@gmail.com)]

2 结 果 2.1 高表达的蛋白激酶

对GEO数据库中34例下咽癌样本的全基因组表达谱芯片(编号：GSE2379)进行分析并与激酶数据库收录的激酶基因进行比对，筛选出差异表达的激酶基因，结果显示下咽癌样本表达谱芯片中3个高表达激酶基因分别为PKC-β、CDK6和CDC42，差异倍数≥2.0且P <0.05。

2.2 高表达激酶的Real-time PCR验证

Real Time-PCR的数值经2-ΔΔCt分析法计算后得出，结果显示与对照组比较，在FaDu细胞组中各激酶表达量的数值为PKC-β(2.29±0.78)，P <0.05；CDK6(1.70±0.26)，P <0.01；CDC42(2.37±0.31)，P <0.01，这些激酶在FaDu中高表达，与芯片结果一致(图 1)。

图 1 Real-time PCR检测激酶基因在FaDu细胞中的表达量 Figure 1 The expression of kinase genes in FaDu cells was detected by Real-time PCR
2.3 高表达激酶调控的通路

通路分析的结果显示3个差异激酶调节着复杂的通路网络，从而证明这3个激酶具有重要的生物学作用。为了更好的研究这些激酶的功能，我们利用Cytoscape 2.8.2 软件将此结果绘制成激酶-通路网络图(图 2)。

图 2 Cytoscape 2.8.2 软件绘制的差异表达激酶调控的通路网络图 Figure 2 Cytoscape 2.8.2 software was used to establish the differentially expressed kinase genes-pathway network
2.4 激酶抑制剂及其在癌症中的应用

激酶抑制剂的筛选结果显示共有5个激酶抑制剂调控PKC-β，4个激酶抑制剂调控CDK6，3个激酶抑制剂调控CDC42(图 3)。

图 3 利用激酶-抑制剂-图书馆网站筛选出5个激酶的激酶抑制剂 Figure 3 The kinase inhibitors of 5 kinases were screened by kinase-inhibitor-library website

文献挖掘的结果显示在这12个激酶抑制剂中，8个激酶抑制剂在癌症方面的研究较多，文献>10篇；有4个激酶抑制剂(LY2835219，ML141，ZL278和Flavopiridol-HCL)在癌症方面的研究较少，文献 <10篇(图 4)。

图 4 利用Pubmed数据库和文献挖掘，得到目的激酶抑制剂在癌症研究方面的文献数量 Figure 4 The number of literatures on cancer research was obtained in Pubmed database and by literature mining
3 讨 论

蛋白激酶作为信号转导途径中的中间分子，不仅能通过磷酸化调节蛋白质的活性，还能通过蛋白质的逐级磷酸化，使信号逐级放大，引起细胞反应，调节着从细胞生长到炎症反应的每一步反应。正因其具有如此重要的作用，蛋白激酶被视为治疗癌症、炎症、糖尿病等多种疾病的新靶点并得到广泛研究[5-7]。

本次实验，我们利用GEO数据库和SAM软件筛选出差异表达基因。GEO数据库是世界上最大的存储高通量公共数据库，现已收录300 000个样本数据，涉及16亿个基因表达信息，数据全面，是一个优秀且免费的全球生物信息数据共享平台[8]。SAM软件是基于R语言基础上的生物信息软件[9]，能够筛选出高通量样本中差异表达的数据，但是仅从数学和统计学层面并不能排除样本中的假阳性数据。因此，针对筛选出的差异基因中的目的基因，还需要进行更为精确的PCR实验来验证其准确性。在下咽癌组织的差异基因中，我们发现了高表达的3个蛋白激酶基因PKC-β、CDK6和CDC42。PKC-β是蛋白激酶C家族的一员,属于多功能丝氨酸和苏氨酸激酶。多项研究表明PKC-β在癌症的发生发展过程中起到重要作用。Basson等[10]发现，激活的PKC-β能够调控IkB-NF-kB信号通路提高肺鳞状细胞癌的增殖能力。He等[11]的研究发现，通过激活PKC-β能够上调VEGF从而促进胃癌的血管生成能力。Fridberg等[12]的研究证实，PKC-β在前列腺癌中表达增高，能通过调节癌基因PTEN加速肿瘤生长且严重影响预后。PKC-β下游的这些靶基因，如VEGF，PTEN，对于促进癌症的发生发展的作用已经早有定论且一直是癌症研究的热门靶点，通过抑制PKC-β来干扰和阻断它的下游通路对于癌症的治疗可能起到关键作用。CDK6属于细胞周期蛋白依赖性激酶CDK家族，促进多种癌症的发生发展，如：肝癌、卵巢癌、前列腺癌等[13-15]。Zen等[16]发现抑制CDK6之后，TGF-β随之下调，肝癌生长被抑制。另有研究发现CDK6可能通过STAT3通路介导与下咽癌相近的喉癌细胞G1期阻滞[17]。Kwon等[18]发现，通过抑制CDK6的表达能下调HIF-1从而抑制肿瘤的生长。这些实验结果强有力地支持了我们的通路分析的结果，CDK6具有成为抗癌治疗靶点的潜力。CDC42属于Rho家族蛋白，具有GTP酶活性，研究表明[19]CDC42的活化能够促进肺鳞状细胞癌的侵袭和转移。Razidlo等[20]发现抑制CDC42后，肿瘤转移驱动基因VAV1也受到抑制，使得肿瘤的转移和侵袭能力下降。这些结果提示我们这3种蛋白激酶能够通过激活致癌基因或通路发挥促癌作用，在未来，针对它们的靶向抗癌疗法具有巨大潜力。

近年来，随着蛋白激酶作为癌症治疗靶点的研究热潮逐渐兴起以及转化医学思想越来越受重视，激酶抑制剂的研发和临床应用也取得了迅猛发展，实验室研究成果向临床实践转化的抑制剂型新药也越来越多[21]。本实验针对3个在下咽癌组织中高表达的激酶，筛选出调节它们的12个激酶抑制剂，如图 3。其中Flavopiridol、GF109203X、Go6976、Ro31-8220Mesylate、NSC23766、Go6983、Enzastaurin、SNS-032已经被用于癌症治疗或相关实验中。LY2835219，ML141，ZL278和Flavopiridol-HCL在癌症研究方面还较少。Flavopiridol是一种黄酮类化合物，研究显示它能够抑制CDK6等细胞周期依赖蛋白激酶，从而促进细胞凋亡、抑制血管发生[22]，与癌症相关研究已达363篇。研究表明，ML141是一种新型激酶抑制剂，它通过抑制CDC42来促进肿瘤细胞凋亡[23]。ML141自2010年发现以来研究逐渐增多，但在癌症的治疗与研究中还很少。Enzastaurin作为PKC-β的激酶抑制剂已进入2期临床研究，实验证实它能够延长75%的肺癌患者生存期[24]，Enzastaurin在治疗胶质瘤方面也已进入1期临床研究[25]。以上证据证明，我们分析筛选的结果准确，这12种激酶抑制剂均具有通过抑制其靶激酶起到抗肿瘤的作用。值得注意的是,LY2835219，ML141，ZL278和Flavopiridol-HCL这4个激酶抑制剂抑制其靶激酶的作用明显，但在癌症方面的研究和应用较少，具备潜在的抗癌作用。以上12个激酶抑制剂还没有在下咽癌方面的相关文献报道，本次研究的成果很可能为下咽癌的分子靶向治疗提供新的切入点。在看到激酶抑制剂的应用前景的同时，一些伴随而来的问题同样不容忽视。Blevins等[26]发现，酪氨酸酶抑制剂在治疗甲状腺癌的过程中，肿瘤的血管生成受到抑制，但与此同时也促使患者的消化系统形成瘘道，从而产生较为严重的并发症。因此，如何解决激酶抑制剂在治疗肿瘤过程中产生的并发症也是未来肿瘤靶向治疗研究中必不可少的一部分。

目前下咽癌的主要治疗手段为手术及放疗，但多数患者确诊时已是中后期，5年生存率仅为25%～40%。其预后差的主要原因包括发病位置隐蔽，肿瘤生长速度快和易发生淋巴结转移等[27]。激酶抑制剂能有效促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成，且具有不良反应小、对机体损伤小等特点，可以作为辅助手术和放化疗的新手段。本次研究中，我们发现在下咽癌中高表达的激酶PKC-β、CDK6和CDC42均具有促癌作用，可能成为下咽癌分子治疗的新靶点，而这些激酶的抑制剂也具备成为抗下咽癌新药的潜力。同时，本文将生物信息学方法，基础实验与临床转化思想相结合也为下咽癌的分子靶向治疗提供了新的方法学参考。

参考文献
[1] Gourin C G, Terris D J. Carcinoma of the hypopharynx[J]. Surg Oncol Clin N Am,2004, 13 (1) : 81-98. (0)
[2] Buckley J G, MacLennan K. Cervical node metastases in laryngeal and hypopharyngeal cancer: a prospective analysis of prevalence and distribution[J]. Head Neck,2000, 22 (4) : 380-385. (0)
[3] American Society of Clinical Oncology, Pfister D G, Laurie S A, et al. American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline for the use of larynx-preservation strategies in the treatment of laryngeal cancer[J]. J Clin Oncol,2006, 24 (22) : 3693-3704. (0)
[4] Piirsoo A, Kasak L, Kauts M L, et al. Protein kinase inhibitorSU6668 attenuates positive regulation of Gli proteins in cancer[J]. Biochim Biophys Acta,2014, 1843 (4) : 703-714. (0)
[5] Manning G, Whyte D B, Martine R, et al. The protein kinase complement of the human genome[J]. Science,2002, 298 (5600) : 1912-1934. (0)
[6] Okkenhaug K. Signaling by the phosphoinositide 3-kinase family inimmune[J]. Annu Rev Immunol,2013, 31 : 675-704. (0)
[7] Kizub I V, Klymenko K I, Soloviev A I. Protein kinase C in enhanced vascular tone in diabetes mellitus[J]. Int J Cardiol,2014, 174 (2) : 230-242. (0)
[8] Barrett T, Suzek T O, Troup D B, et al. NCBI GEO: mining millions of expression profiles-database and tools[J]. Nucleic Acids Res,2005, 33 (Database issue) : D562-566. (0)
[9] Joost S, Kalbermatten M, Bonin A. Spatial analysis method (sam): a software tool combining molecular and environmental data to identify candidate loci for selection[J]. Mol Ecol Resour,2008, 8 (5) : 957-960. (0)
[10] Basson M D, Zeng B, Downey C, et al. Increased extracellular pressure stimulates tumor proliferation by a mechanosensitive calcium channel and PKC-β[J]. MolOncol,2015, 9 (2) : 513-526. (0)
[11] He L F, Wang T T, Gao Q Y, et al. Stanniocalcin-1 promotes tumor angiogenesis through up-regulation of VEGF in gastric cancer cells[J]. J Biomed Sci,2011, 18 (1) : 39-48. (0)
[12] Fridberg M, Kjellstrm S, Anagnostaki L, et al. Immunohistochemical analyses of phosphatases in childhood B-cell lymphoma: lower expression of PTEN and HePTP and higher number of positive cells for nuclear SHP2 in B-cell lymphoma cases compared to controls[J]. Pediatr Hematol Oncol,2008, 25 (6) : 528-540. (0)
[13] Xiao F, Zhang W, Zhou L, et al. microRNA-200a is an independent prognostic factor of hepatocellular carcinoma and induces cell cycle arrest by targeting CDK6[J]. Oncol Rep,2013, 30 (5) : 2203-2210. (0)
[14] Xia B, Yang S, Liu T, et al. miR-211 suppresses epithelial ovarian cancer proliferation and cell-cycle progression by targeting Cyclin D1 and CDK6[J]. Mol Cancer,2015, 14 (1) : 57-70. (0)
[15] Comstock C E, Augello M A, Goodwin J F, et al. Targeting cell cycle and hormone receptor pathways in cancer[J]. Oncogene,2013, 32 (48) : 5481-5491. (0)
[16] Zen Y, Harada K, Sasaki M, et al. Intrahepatic cholangio carcinoma escapes from growth inhibitory effect of transforming growth factor-beta1 by overexpression of cyclin D1[J]. Lab Invest,2005, 85 (4) : 572-581. (0)
[17] Wang J, Li X, Lu X, et al. The regulation of stat3 signal transduction pathway to G1 to S phase of laryngo carcinoma cell[J]. Clin J Otorhinolarynol Head Neck Surg,2008, 22 (15) : 699-703. (0)
[18] Kwon D Y, Lee H E, Weitzel D H, et al. Synthesis and Biological Evaluation of Manassantin Analogues for Hypoxia-Inducible Factor 1α Inhibition[J]. J Med Chem,2015, 58 (19) : 7659-7671. (0)
[19] Zupa A, Improta G, Silvestri A, et al. A pilot characterization of human lung NSCLC by protein pathway activation mapping[J]. J Thorac Oncol,2012, 7 (12) : 1755-1766. (0)
[20] Razidlo G L, Magnine C, Sletten A C, et al. Targeting Pancreatic Cancer Metastasis by Inhibition of Vav1, a Driver of Tumor Cell Invasion[J]. Cancer Res,2015, 75 (14) : 2907-2915. (0)
[21] Cheung C H, Coumar M S, Chang J Y, et al. Aurora kinase inhibitor patents and agents in clinical testing: an update (2011-13)[J]. Expert Opin Ther Pat,2014, 24 (9) : 1021-1038. (0)
[22] Murphy C G, Dickler M N. The Role of CDK4/6 Inhibition in Breast Cancer[J]. Oncologist,2015, 20 (5) : 483-490. (0)
[23] Chen C, Song X, Ma S, et al. Cdc42 inhibitor ML141 enhances G-CSF-induced hematopoietic stem and progenitor cell mobilization[J]. Int J Hematol,2015, 101 (1) : 5-12. (0)
[24] Gray J E, Altiok S, Alexandrow M G, et al. Phase 2 randomized study of enzastaurin (LY317615) for lung cancer prevention in former smokers[J]. Cancer,2013, 119 (5) : 1023-1032. (0)
[25] Rampling R, Sanson M, Gorlia T, et al. A phase I study of LY317615 (enzastaurin) and temozolomide in patients with gliomas (EORTC trial 26054)[J]. Neuro Oncol,2012, 14 (3) : 344-350. (0)
[26] Blevins D P, Dadu R, Hu M, et al. Aerodigestive fistula formation as a rare side effect of antiangiogenic tyrosine kinase inhibitortherapy for thyroid cancer[J]. Thyroid,2014, 24 (5) : 918-922. (0)
[27] 潘新良, 雷大鹏, 许风雷, 等. 下咽癌的外科治疗[J]. 山东大学耳鼻喉眼学报,2007, 21 (1) : 1-6.
PAN Xinliang, LEI Dapeng, XU Fenglei, et al. Surgical treatment of lower pharyngeal carcinoma[J]. J Otolaryngol Ophthalmol Shandong Univ,2007, 21 (1) : 1-6. (0)