2016, Vol. 30
2. Department of Anatomy and Molecular Embryology, Institute of Anatomy, Ruhr University Bochum, 44780 Bochum, Germany
2. Department of Anatomy and Molecular Embryology, Institute of Anatomy, Ruhr University Bochum, 44780 Bochum, Germany
Wnt家族在脊椎动物内耳的发育及细胞的分化中起决定作用[1-2],经典Wnt信号通路调节内耳细胞的增殖和分化[3]。Axin2是Axin的等位基因，是经典的Wnt调节通路中一个负性调节因子，它通过促进β-catenin降解，抑制信号传导，保证Wnt信号传导通路稳定性[4]。实验证明，Wnt信号传导通路存在于大多数颅面发育过程中[5-7]。因此，研究Wnt信号传导通路中的负性调节因子Axin2在内耳发育过程中的详细调节机制，对了解内耳发育、先天性疾病、肿瘤等有重要意义。
1 材料与方法 1.1 探针在本研究中所用的pEGFP-cAxin2-shRNA质粒和对照质粒是由德国波鸿鲁尔大学的Beate Brand-Saberi 教授及戴方平博士提供。用EcoRI解链pCMS-EGFP-cAxin2质粒，再用T3 RNA多聚酶合成cAxin2的反序列探针。作为对照，顺序列cAxin2探针的制备是先用XbaI解链pCMS-EGFP-cAxin2质粒，再用T7 RNA多聚酶合成。
1.2 鸡胚将60只已受精的白来亨鸡蛋(兰州正大有限公司种鸡场提供)置入温度38 ℃、相对湿度80％的孵化箱内孵化至各实验要求的阶段。鸡胚发育按Hamburger和Hamilton[8](1951)标准分期。
1.3 原位杂交宰杀HH11-28各期鸡胚并用4%的PFA在4 ℃中固定过夜。将固定的鸡胚在甲醇中经过逐级脱水，置-20 ℃中储存。用于表达cAxin2的探针用地高辛RNA标记盒(Roche) 标记。全胚胎原位杂交并拍照。挑选鸡胚用Leica震动切片机(德国LEICA公司)做切片，厚度30～40 μm。
2 结果cAxin2最早期出现在鸡胚内耳发育的HH-14+期，表达在耳杯背侧部分的区域内(组图 1里L图黑箭所示)。切片显示，cAxin2基因局限的表达在耳杯背侧区域并稍稍向中间延伸(组图 1里F图黑箭所示)。邻近耳杯背侧部分的后脑背侧部分也可见到轻微的cAxin2探针标记(组图 1里F图黑箭头所示)。在HH-14+期，cAxin2在耳杯内的表达方式与HH-16+的表达方式相似，但信号相对增强(组图 1里 A、G和M图黑箭所示)。
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图 1 cAxin2在鸡胚发育内耳 HH14+-HH24+期的全胚胎表达方式 Figure 1 Whole mount expression of cAxin2 in inner ear growth of chick embryo in HH14+-HH24+ |
当鸡胚发育到HH-17+期，正好是耳杯闭合，形成耳囊或耳泡。此期可见cAxin2强烈地表达在耳泡背侧部分并延伸到上外侧部的上皮细胞中(数据未显示)。从原位杂交标本全胚胎图像耳囊的背侧及侧面观可见与HH-17期相同的cAxin2表达方式延续到了HH-18期，可见强cAxin2信号仍然在耳囊的背侧(组图 1里B、H、N图黑箭所示)。横向及水平切片显示在整个初始的内淋巴导管 (组图 2里B、D图黑箭所示)、耳囊上内侧壁及上外侧壁均有强的cAxin2标记(组图 2里A-C及E图黑箭所示)，强信号还突出表现在耳囊的前外侧壁及后内侧壁的上皮内(组图 2里E图黑箭所示)，该两区域的上皮细胞分别与前壶腹嵴及上壶腹嵴的发生有关[9]。此期中后脑背侧区域邻近耳囊背侧部分也被cAxin2染色，且信号明显的强于之前的各发育阶段(组图 2里A-C图黑箭头所示)。
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图 2 cAxin2在鸡胚发育内耳HH14+-HH24+期横向及水平切片的表达方式 Figure 2 Transverse and horizontal section expression of cAxin2 in inner ear growth of chick embryo in HH14+-HH24+ |
在HH-20+期，全胚胎侧面观显示cAxin2信号不仅明显的标记在整个内淋巴导管上皮内而且向耳囊背侧部分前方和后方区域扩张(组图 1里C，I，O图黑箭所示)。横向和水平切片可见cAxin2表达仍然主要集中耳囊上皮的背侧部分。还可看到两个膨大：内淋巴导管和垂直小管囊(组图 2里H图ed和vp所示)。cAxin2探针主要标记在耳囊内侧壁中上部分 (组图 2里H图黑箭所示) 以及内侧壁的前部(喙侧)和后部(尾侧)(组图 2里G、I、K图黑箭所示)。在后脑区域，可看到逐渐汇合集中的数个两侧对称的点片状分布的cAxin2信号区(组图 2里H、I图黑箭头所示)。而在耳囊的腹侧部分，无论HH-18+期、HH-20+期、cAxin2信号均呈阴性(组图 2里F、L图黑箭头所示)。
在HH-23期，背侧和侧面观显示：与老幼各发育期胚胎相比，cAxin2 阳性信号在此期是最强的(组图 2里D、J、P图黑箭所示)。在HH-24期，全胚胎标本显示cAxin2表达区域不断扩大，尤其在耳囊的前半部背侧，内淋巴囊仍然是强信号(组图 2里E、K、Q图黑箭所示)。横向及水平切片显示，cAxin2 在耳囊的表达方式更广泛、更复杂(组图 2里M-R图黑箭所示)。在大部分喙侧横向切片中，在耳囊前内侧区域可见高表达的cAxin2信号(组图 1里L图黑箭所示)。穿过内淋巴管的切片上，全部的内淋巴管和内侧壁上皮细胞都被cAxin2 探针强烈标记(组图 2里N图黑箭所示)，在外侧壁上还可见弱而局限的cAxin2染色斑(组图 2里N图红箭所示)，该斑区域与外侧壶腹嵴的发生有关[9]。而在耳囊的腹侧，与未来耳蜗管发生有关的靠腹内侧壁上皮细胞[9]对cAxin2探针呈阴性表达(组图 2里N图黑箭头之间区域所示)。在耳囊尾侧切片中，cAxin2强烈地表达在耳囊后内侧区域上皮细胞中(组图 2里O图黑箭所示)。水平切片上，可见耳囊内侧壁上皮对cAxin2呈强阳性表达(组图 2里Q图黑箭所示)，该区域与囊斑的发生有关[9]，但垂直囊导管无cAxin2阳性表达(组图 2里P图vp所示)。在耳囊腹侧切片上可见一局限于前内侧壁的cAxin2阳性表达区域(组图 2里R图黑箭所示)，未来的球囊斑多起源于此处[9]。在这张切片还可以看到腹侧的耳囊上皮细胞对cAxin2探针呈阴性表达(组图 2里R图黑箭头之间的区域所示)。随后，从HH-24期以后更成熟的各期胚胎，耳囊内的上皮细胞对cAxin2的阳性表达迅速衰退(数据未显示)。
3 讨论Wnt信号通路在细胞增殖分化和形态形成过程中起着非常重要的作用。在此信号通路中Axin2对β-catenin的负调控是保证Wnt信号传导通路稳定性的中心环节。当Axin2突变或功能失调后使其功能缺失或降低，则β-catenin功能获得增强，其主要结果是在细胞质及细胞核内提升β-catenin的水平，继而β-catenin与TCFs结合的能力增强并改变了随后TCF调节基因的转录[4, 10]。因此，激活或抑制被β-catenin-TCF途径调节的靶基因是发育学和癌症发生中Wnt信号通路失调节的主要结果。
据报道[11]，Wnt信号传导通路参与调控颅面形态发生。Wnt1和Wnt3a都表达在神经管的背外侧区域，而此区域产生颅面神经脊细胞[12]。Wnt1-/-，Wnt3a-/-双基因敲除致突变小鼠显示没有前厅器官组分，所残留下来的只是缩短了的耳蜗样结构[13]。Axin2突变小鼠显示出成骨祖细胞表达增强、骨化加速、成骨成分表达激活及骨矿化增加。将Axin2失活后，在体内和体外均可促进增殖和分化[14]。在小鼠，失活Axin2后可诱发颅骨过早骨化过程。在人类则表现为一种先天性缺陷，该缺陷常与视觉、听觉和呼吸障碍有关[15]。这种在Axin2突变小鼠中所观察到的颅骨骨缝早熟性骨化融合与激活β-catenin信号传导通路有关[14]。
在图 1中，A-E，L-Q 显示鸡胚用cAxin2做原位杂交后分别在HH 14+、16+、18+、20+、23、24各期，背侧面和侧面观鸡胚发育内耳的全景像。A-E的方框标出被放大的G-K耳部侧面观。
图 2里的 A-C，G-I，M-O和 D-F，J-K，P-R 表示HH 18+、20+、24+横向及水平切片图。方向指示在图 2里横向及水平切片上方。黄线和相应的黄色字母指示胚胎HH18+、20+、24横向及水平切片的大致平面。
本实验中，观察了cAxin2基因在鸡胚内耳中在时间与空间上动态的表达方式。观察到cAxin2的表达信号最早出现在HH-14+期的鸡胚耳杯最背侧区域。至HH-18+期，在耳囊的背侧部分可见强的cAxin2表达信号主要表达在整个内淋巴导管、耳囊内侧壁及外侧壁上部和外侧壁前部及内侧壁后部上皮内，后两处分别与前壶腹嵴和后壶腹嵴的发生有关[9]。在HH-24期，整个内淋巴导管仍然对cAxin2呈强阳性表达，分别与未来的球囊斑和椭圆囊斑发生有关的内侧壁上皮和腹侧的内侧前部区域也呈cAxin2强标记。还可看到局限于外侧壁呈弱染色的斑状区域，此处与外侧壶腹嵴的发生有关[9]。而在最靠腹内侧壁与未来的蜗管发生有关[9]的耳蜗样上皮组织内为cAxin2阴性表达。
cAxin2最早期的表达出现在HH-14+，首先表达在耳杯的背部(组图 1里L、F图黑箭所示)和后脑的背侧区域(组图 1里F图黑箭头所示)。在HH16+，鸡胚耳杯可见相同但更强的cAxin2表达区域 (组图 1里A、G、M图黑箭所示)。至 HH18+，cAxin2阳性表达部位还是主要分布在耳囊的背侧 (组图 1里B、H、N图黑箭所示)。切片上可见，整个初始的内淋巴导管呈cAxin2强表达(组图 2里B、D图黑箭所示)，并延伸到内上和外上壁(组图 2里A-C、E图黑箭所示)，主要集中在外侧壁前上部及内侧壁后上部上皮内(组图 2里E图黑箭所示)。与耳囊背部相邻的后脑背部区域亦为cAxin2染色阳性，且较前期胚胎染色强(组图 2里A-C图黑箭所示)。在HH-20+，cAxin2主要表达在耳囊的背部内侧壁的中上部(组图 2里H图黑箭所示)和前内侧壁(喙侧切片)及后内侧壁(尾侧切片)(组图 2里G、I、K图黑箭所示)。而cAxin2杂交信号在HH18和HH20+胚胎的腹侧均呈阴性表达(组图 2里F、L图黑箭头所示)。在HH-23，与幼老各期胚胎相比，cAxin2信号在耳囊内的表达最强(组图 1里D、J、P图黑箭所示)。HH-24，杂交胚胎全景观显示cAxin2表达主要在耳囊的背部和前部(组图 1里E、K、Q图黑箭所示)。整个内淋巴导管仍然呈cAxin2强阳性染色，并高标记了耳囊的内侧壁中上部、内侧壁前部和后部(组图 2里M-R图黑箭所示)，还可看到弱染色并局限于外侧壁的斑状阳染区(组图 2里N图红箭所示)。在最靠腹侧呈耳蜗样上皮的内侧壁腹侧为cAxin2阴性表达(组图 2里N、R图黑箭头之间区域所示)。
缩写词: D，dorsal; M,medial; R,rostral; vp，vertical pouch; ed，endolymhpatic duct.
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