以视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI)为病理生理过程的一类疾病是临床诊疗过程中常见的视功能损伤性疾病，严重者可导致视功能不可逆性损伤^[1]。目前，研究发现，RIRI机制较为复杂，主要包括兴奋性氨基酸的毒性作用、氧自由基及其产物增多、细胞内钙超载、细胞凋亡、炎症反应参与等^[2]。作为一种重要的兴奋性氨基酸，谷氨酸是多种神经退行性疾病神经元死亡的主要原因，与缺血引起的视网膜神经细胞损伤密切相关，可导致视网膜神经节细胞破坏和死亡，并被认为是缺血再灌注损伤时造成组织损伤的可能机制之一^[3]。重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor，rh-bFGF)是一种具有多种生物活性的神经营养因子。最新研究表明，rh-bFGF能有效保护神经元免受兴奋性氨基酸所致的损伤，减少缺血再灌注后受损神经细胞的损伤，但具体作用机制尚不完全清楚^[4-5]。本实验通过建造兔RIRI模型，并于玻璃体腔内注射rh-bFGF，以观察rh-bFGF对视网膜组织细胞形态及谷氨酸含量的影响，旨在进一步探讨谷氨酸在RIRI中的作用及rh-bFGF对抗兴奋性氨基酸毒性损伤的可能保护机制。

66只雄性体健、外眼及眼底正常的大耳白兔(本院动物中心购入)纳入本实验，体质量(2.5±0.2)kg，饲养于相同生长环境。将其分为3组：A组(RIRI组)30只、B组(RIRI+rh-bFGF组)30只、C组(正常假手术组)6只。缺血再灌注后6、12、24、48、72 h，A、B 2组又依次分为5个亚组，每组6只。主要试剂和仪器：rh-bFGF粉剂(上海西塘生物科技有限公司)，谷氨酸试剂盒(南京建成生物工程研究所)，高效液相色谱分析仪，电子分析天平及光电显微镜。

A、B 2组制备RIRI模型。建立RIRI模型前，B组在缺血再灌注刚开始时以微量注射器抽取配制好的rh-bFGF溶液10 μL(相当于rh-bFGF 2 μg)注入玻璃体，同时向A组兔玻璃体内注射生理盐水溶液10 μL作为对照。采取前房加压灌注法：以1 g/L乌拉坦5 mg/kg注射兔耳缘静脉给予麻醉，麻醉满意后固定于实验台上，均选取左眼造模；A、B 2组给予散瞳药散开瞳孔，一端连有5号头皮针，另一端连接生理盐水输液瓶，将头皮针沿角巩膜缘处穿刺入前房，同时缓慢升高输液瓶，使其产生16.7 kPa压力^[6-7]。此时球结膜、虹膜颜色变苍白，视网膜明显水肿且苍白。60 min后，缓慢降低输液瓶至动物眼水平，此时球结膜、虹膜颜色恢复正常，视网膜血供恢复橘红色，提示RIRI造模成功。A、B 2组分别于缺血再灌注后6、12、24、48、72 h进行处死，并摘除眼球。C组给予前房穿刺，无其他操作，处死后摘除眼球。所有组织标本均行HE染色，观察组织病理变化。

烘干切片，脱蜡，乙醇复水，每个浓度2 min；苏木素染色，0.5%盐酸乙醇分化，1%氨水泛蓝，1%伊红染色后乙醇脱水，各浓度2 min；二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察兔视网膜各层组织结构的变化。

标本去除眼前节，显微镜下剥离视网膜，称质量，匀浆、粉碎，放入EP管中，置于－80 ℃冰箱内保存备用。

采用SPSS 18.0软件,定量资料以x±s表示，采用t检验。取检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

显微镜下观察，A组视网膜出现高度水肿，层次紊乱，细胞结构疏松，视网膜节细胞(retinal ganglion cells，RGC)出现空泡样变性，神经节细胞数目减少，感光细胞结构欠规整，内、外核层细胞出现空泡变性，见图 1；B组视网膜结构层次和细胞组织变化与A组大致相同，但损害程度较A组明显减轻，见图 2；C组视网膜各层次清晰，细胞结构规整，呈平行排列，RGC呈单层排列、规则，无空泡变性，见图 3。

图 1

图 1 A组缺血再灌注后12 h视网膜HE染色(×400) Figure 1 HE staining of retina in group A 12 h after ischemia-reperfusion injury(×400)

图 2

图 2 B组缺血再灌注后12 h视网膜HE染色(×400) Figure 2 HE staining of retina in group C(×400)

图 3

图 3 C组视网膜HE染色(×400) Figure 3 HE staining of retina in group C(×400)

缺血再灌注后6、12、24、48、72 h，A、B 2组视网膜谷氨酸含量均显著高于C组，且各时间点比较差异均有统计学意义(P＜0.01)。A、B 2组谷氨酸含量随RIRI时间推移逐渐升高，24 h达高峰，之后缓慢下降；与A组比较，B组各时间点谷氨酸含量明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表 1。

表 1

表 1 3组不同时间点视网膜谷氨酸含量比较( x±s,μmol/g prot) Table 1 Comparison of retinal glutamate contents in three groups at different time points(x±s,μmol/g prot) 组别 例数 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h A组 6 68.71±5.17** 110.17±8.91** 135.25±9.23** 98.26±7.11** 76.21±13.90** B组 6 58.12±5.81**## 79.39±13.19**## 109.19±9.18**## 71.12±7.89**## 51.02±6.17**## C组 6 25.12±2.71 22.33±4.14 24.92±3.64 28.32±2.65 23.74±3.21 **P＜0.01 vs C组；##P＜0.01 vs A 组。

表 1 3组不同时间点视网膜谷氨酸含量比较( x±s,μmol/g prot) Table 1 Comparison of retinal glutamate contents in three groups at different time points(x±s,μmol/g prot)

RIRI是指缺血性眼病患者的视网膜在恢复供血后，出现明显的功能障碍，甚至发生不可逆性损伤，再灌注并能不缓解视网膜细胞的损伤，反而加剧了细胞死亡^[8]。RIRI是临床上很常见的一类病理生理过程，视网膜缺血缺氧、青光眼、糖尿病视网膜病变、视网膜变性等均与之相关。因此，进一步探讨RIRI的发病机制及高效的治疗方法对此类疾病的治疗尤为重要。谷氨酸作为一种神经递质刺激性氨基酸，在眼部的正常生理状态及缺血引起的视网膜损伤的病理生理过程中发挥重要作用。Aikawa等^[9]通过大鼠视网膜缺血再灌注试验，在视网膜内层发现兴奋性氨基酸受体，且其mRNA表达明显增多，提示在视网膜细胞坏死过程中二者起着相当重要的作用。包秀丽等^[10]通过实验发现，视网膜缺血时大量的谷氨酸、天门冬氨酸涌入细胞外液，再次证明兴奋性氨基酸的神经毒性作用可导致视网膜缺血细胞性损伤。缺血再灌注状态下，视网膜谷氨酸含量升高，细胞外积聚的谷氨酸可与其相应膜受体结合，导致细胞内钙离子浓度增加，从而激活细胞内的蛋白激酶C、钙依赖性蛋白激酶、一氧化氮合酶等，同时还可产生一系列导致神经元损伤或死亡的活性分子。可见，谷氨酸是通过触发视网膜缺血缺氧神经细胞损伤级联反应来发挥氨基酸的毒性作用，从而导致神经元损伤或死亡。

作为一种重要的神经营养因子，rh-bFGF与相应受体结合后，可诱导内皮细胞迁移，促进毛细血管增生，从而形成胶原纤维^[11]。宋庆磊等^[12]研究发现，rh-bFGF可使血管内皮细胞迅速增殖，进而加速局部组织的微循环代谢和营养供给。姜义娜等^[13]通过研究bFGF对大鼠缺血再灌注脑损伤的保护作用，发现经bFGF治疗后，脑缺血再灌注大鼠的神经元损伤程度明显降低。目前，研究^[14-15]认为，rh-bFGF对RIRI治疗作用的可能机制是多方面的。rh-bFGF可减少自由基损害，通过影响钙离子结合蛋白而阻止细胞内钙离子超载，维持细胞内钙离子环境稳定，从而发挥抗损伤作用，同时bFGF具有保护神经元免受兴奋性氨基酸等所致的损伤，并可通过提高蛋白质合成效率来影响细胞的生物学行为。此外，bFGF还可通过抑制细胞凋亡来发挥保护、促进细胞功能恢复和神经营养的作用。

本实验通过观察RIRI后的病理学变化，发现B组视网膜结构层次和细胞组织变化与A组大致相同，均出现视网膜水肿，层次紊乱，细胞结构疏松，RGC出现空泡样变性，神经节细胞数目减少，感光细胞结构欠规整，内、外核层细胞出现空泡变性，但其损害程度较A组明显减轻。通过比较3组不同时间点视网膜谷氨酸含量，发现缺血再灌注后6、12、24、48、72 h，A、B 2组视网膜谷氨酸含量均显著高于C组。随RIRI时间推移，A、B 2组谷氨酸含量逐渐升高，24 h达高峰，之后缓慢下降；与A组比较，B组各时间点谷氨酸含量明显降低。以上结果均说明，RIRI+rh-bFGF能明显降低谷氨酸含量，对保护视网膜神经细胞免受谷氨酸损害具有一定作用，可能是rh-bFGF治疗RIRI的作用机制之一。

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