2016, Vol. 30
2. 福建医科大学附属第一医院 中心实验室，福建 福州 350005 ;
3. 福建医科大学附属第一医院 检验科，福建 福州 350005
2. Clinical Laboratory, The First Affliated Central Laboratory, Fuzhou 350005, Fujian, China ;
3. Clinical Laboratory, The First Affliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, Fujian, China
喉癌是常见的头颈部肿瘤之一，好发于中老年男性，预计全球每年发病率约160 000例，死亡病例约82 000例[1]。吸烟和饮酒被认为是喉癌的主要诱因，特别是在声门上型喉癌发病中起到重要作用，长期暴露于煤粉尘、硬质合金粉尘、氯化的溶剂等也与喉癌发生密切相关[2]。 喉癌患者继发其他部位原发肿瘤的概率高，5年内达14%，10年内达26%，15年内可达37%[3]。喉癌的预后与肿瘤TNM分期相关，其中淋巴结转移比局部进展更为重要。尽管近年来手术技巧和放疗技术有所提高，但是近30年来总体生存率没有明显提高，5年生存率约64%[4]。
程序性细胞死亡蛋白4基因(programmed cell death 4，PDCD4)是一种新近发现的抑癌基因，研究表明, 下调PDCD4基因可以使得β-catenin异位表达并导致细胞上皮间质转化, 而上皮间质转化是指有极性的上皮细胞向间质细胞转化的过程，在肿瘤细胞的迁移侵袭过程中起着重要的作用，是肿瘤细胞转移的重要因素之一[5]。研究证明, PDCD4基因在喉癌肿瘤组织中低表达[6]，但PDCD4在喉癌中与β-catenin的关系以及二者在肿瘤发生发展中的具体分子机制尚不明确。我们利用人喉癌Hep-2细胞系下调 PDCD4基因表达，观察细胞增殖能力的变化，观察Hep-2细胞中β-catenin表达变化。现报告如下。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株人喉癌细胞株Hep-2细胞购自ATCC(American Type Culture Collection)。
1.1.2 主要试剂胎牛血清、1640培养基购自Hyclone公司，胰蛋白消化酶、二甲基亚砜购自Sigma公司；BCA蛋白测定试剂盒购自thermo scientific； PDCD4兔抗人单克隆抗体、β-Catenin兔抗人单克隆抗体购自Cell Signaling Technology，羊抗兔辣根过氧化物酶标记二抗购自Abcam，小鼠抗人GAPDH单克隆抗体、羊抗鼠辣根过氧化物酶标记二抗购自biolegend，ECL显色试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。LipofectamineTM 2000脂质体购自Invitrogen公司，Puromycin购自Sigama公司。RT-PCRMix购自Promaga，逆转录试剂盒购自生工。
1.1.3 PDCD4表达质粒本研究根据NCBI上公布的序列号为NM_014456的PDCD4 mRNA序列设计了四条短发夹RNA(short harpin RNA, shRNA)，见表 1。质粒载体GV248是转录靶向抑制PDCD4 mRNA 的表达质粒，由上海吉凯基因化学技术有限公司设计。该重组质粒在细胞内表达绿色荧光蛋白( green fluorescent protein, GFP)。阴性对照Neg-shRNA的靶序列为随机序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，此序列不与任何人类基因序列同源。
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表 1 shRNA核酸序列 Table 1 Sequence of the shRNA |
Hep-2细胞置于含10%胎牛血清的1640培养基中。培养条件：37 ℃、5% CO2二氧化碳培养箱。
1.2.2 细胞转染和稳定筛选Hep-2细胞，用胰蛋白消化酶消化细胞，以3×105个细胞/孔接种于6 cm培养皿，加入胎牛血清和1640培养液3 mL温育细胞24 h贴壁生长至70%~80%后，用LipofectamineTM 2000 介导质粒转染，荧光镜下观察转染效率。转染后48 h加入2 μg/mL Puromycin筛选阳性克隆。每2~3天更换1次培养液，培养10~12 d后，将Puromycin浓度改为0.5 μg/mL，荧光镜下观察标记含GFP的克隆，挑出克隆继续扩大培养。将筛选出来的稳定克隆应用实时定量RT-PCR验证PDCD4mRNA表达下调水平，选择其中下调最为显著的PDCD4-shRNA8653组多克隆细胞用于后续实验。将转染PDCD4-shRNA和pNeg-shRNA的Hep-2细胞分别命名Hep-2/PDCD4-shRNA和Hep-2/Neg-shRNA。
1.2.3 克隆形成实验将Hep-2/PDCD4-shRNA和Hep-2/Neg-shRNA细胞用胰蛋白消化酶消化成单细胞悬液，计数、稀释，接种于6孔板，每孔500个细胞，加入1640培养基3 mL，CO2体积分数为5%的培养箱，于37 ℃静置培养。培养12~14 d，移弃培养液，PBS漂洗，醋酸甲醇固定，结晶紫液染色，低倍显微镜下计数大于或等于50个细胞的克隆数，计算细胞的克隆形成率。克隆形成率=细胞形成的克隆数/接种细胞数×100%。
1.2.4 实时定量RT-PCR检测PDCD4、β-Catenin基因的表达PBS将各种细胞洗2遍，加入Trizol RNA提取试剂，按步骤提取总RNA。根据NCBI上公布的PDCD4、β-Catenin基因序列，设计-PCR引物，PDCD4上游引物:5′GTG ACG CCC TTA GAA GTG GA 3′，下游引物R:5′CTG CAC CAC CTT TCT TTG GT 3′，PCR产物 111 bp ；β-Catenin上游引物:5′TGG TGA CAG GGA AGA CAT CA 3′，下游引物R:5′CCA TAG TGA AGG CGA ACT GC 3′，PCR产物108 bp。反应程序：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min, 40cycle。以GAPDH为内参，釆用相对定量法来比较表达的差异。
1.2.5 蛋白质印迹法(Western blotting)检测PDCD4、β-Catenin蛋白的表达PBS将各种细胞洗2遍，加入TNE蛋白提取液裂解细胞，同时加入PMSF及Cocktail蛋白酶抑制剂来提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每孔加50 μg总蛋白，10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，用含50 g/L脱脂奶粉的T-BST，37 ℃，封闭1~2 h；加入一抗，4 ℃，温育过夜；T-BST漂洗10 min，4次；辣根过氧化物酶标记二抗(羊抗兔1∶2 000)，37 ℃，温育1 h；T-BST漂洗10 min，4次；ECL显色试剂盒曝光底片，曝光后底片上蛋白条带用Image pro-plus 软件分析量化吸光度，以GAPDH蛋白的含量作为参照，分析PDCD4、β-Catenin蛋白的表达。
1.3 统计学处理采用SPSS 13.0软件进行统计分析，实验数据以x±s表示。组间比较采用成组t检验。 检验水准α=0.05, P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 PDCD4-shRNA成功转染Hep-2细胞荧光显微镜下观察结果，PDCD4-shRNA组和pNeg-shRNA组阳性的Hep-2细胞呈现绿色荧光。两组转染效率均在90%以上(图 1)。
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图 1 转染shRNA 后Hep-2细胞绿色荧光的表达 Figure 1 Expression of green fluorescent protein in Hep-2 cells transfeceted with shRNA |
克隆形成实验检测的结果显示，Hep-2/PDCD4-shRNA组和Hep-2/pNeg-shRNA组细胞分别培养12~14 d，Hep-2/PDCD4-shRNA组的克隆形成率为(12.467±1.361)%, 明显高于Hep-2/pNeg-shRNA组的(8.067±0.945)%(t=-4.598，P=0.010)(图 2)。
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图 2 克隆形成实验结果:上排Hep-2/Neg-shRNA, 下排Hep-2/PDCD4-shRNA。 Figure 2 Result of colony-forming assay. The upper indicated the Hep--2/Neg-shRNA and the lower indicated the Hep-2/PDCD4-shRNA. |
Hep-2/PDCD4-shRNA组PDCD4表达明显减少，Hep-2/PDCD4-shRNA组β-Catenin表达明显增加(表 2)。
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表 2 Hep-2/PDCD4-shRNA组和Hep-2/pNeg-shRNA组细胞PDCD4、β-Catenin mRNA的表达(x±s，n=3) Table 2 Expressions of PDCD4 and β-Catenin mRNA in two groups (x±s，n=3) |
Hep-2/PDCD4-shRNA组PDCD4蛋白相对表达量(0.449±0.022)与Hep-2/pNeg-shRNA组PDCD4蛋白相对表达量(1.059±0.122)比较明显减少(t=4.918, P=0.008)，Hep-2/PDCD4-shRNA组β-Catenin蛋白相对表达量(1.618±0.006)与Hep-2/pNeg-shRNA组β-Catenin蛋白相对表达量(0.740±0.033)比较明显增加(t=25.95，P＜0.01)(图 3)。
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图 3 Weston blot 检测转染前后细胞PDCD4、β-catenin 蛋白的表达。A:Hep-2/Neg-shRNA，B: Hep-2/PDCD4-shRNA。 Figure 3 Expression of PDCD4 and β-catenin in Hep-2/PDCD4-shRN and Hep-2/Neg-shRNA by Weston blotting |
程序性细胞死亡蛋白4(programmed cell death 4，PDCD4)最早是1995年由小鼠基因克隆来，最初命名MA3[7]。PDCD4已被证实是一种重要的肿瘤抑制因子，目前被认为是一种抑癌基因。它抑制肿瘤的早期阶段和肿瘤进展阶段，通过与eIF4A结合，抑制一系列需要eIF4A活化的mRNA翻译而发挥作用[8]，在包括乳腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌、喉癌等多种肿瘤中PDCD4基因表达下调，临床数据表明低表达PDCD4蛋白水平影响肺癌、结肠癌症患者预后[9-13]。PDCD4属细胞周期及凋亡相关的抑癌基因, PDCD4不仅影响细胞程序化死亡, 而且通过抑制蛋白翻译的起始抑制肿瘤的发生。在包括喉癌在内的头颈癌中PDCD4的抑癌机制很大程度上是未知的。
我们拟通过RNAi的方法沉默PDCD4基因在喉癌Hep-2细胞中的表达，探讨该基因对细胞增殖功能和在上皮间质转化中的影响。目前常用的RNAi的研究策略有三种：第一种即为直接合成针对靶基因的siRNA，通过转染的方法使之进入细胞内，参与到RNAi途径，发挥使靶基因沉默的效应。第二种是构建短发夹样RNA(shRNA)的质粒表达载体，转染细胞，在细胞内转录生成shRNA, 利用细胞内的Dicer酶，生成相应的siRNA，发挥RNAi作用。第三种是构建shRNA的病毒表达载体，机制与质粒载体相似。本研究采用的是第二种方法，shRNA在细胞内会自动被加工成siRNA，使靶基因沉默，比siRNA作用更稳定、高效。我们根据NCBI上公布的序列号为NM_014456的PDCD4 mRNA序列设计了四条短发夹RNA。构建质粒载体，靶向抑制Hep-2细胞的PDCD4 mRNA的表达，同时设计阴性对照质粒。经过转染、筛选得到稳定克隆，实时定量RT-PCR检测PDCD4 mRNA水平，我们选择其中mRNA下调最为显著的PDCD4-shRNA8653克隆用于后续实验。与对照组比较，转染PDCD4-shRNA后PDCD4-shRNA8653克隆的Hep-2细胞，其PDCD4基因在mRNA和蛋白水平的表达均下调，克隆形成实验发现转染组Hep-2细胞的增殖能力显著增强，差异有统计学意义。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性，本研究结果说明，Hep-2细胞下调PDCD4基因的表达后可以促进细胞增殖。
β-catenin是细胞内Wnt信号通路中的一个关键因子，Wnt信号通路激活能引起细胞增殖并与细胞的上皮间质转化过程。Wang等[14]利用shRNA下调结肠癌HT29细胞PDCD4的表达，发现下调PDCD4促进肿瘤细胞的侵袭，E-钙黏蛋白表达减少，活性β-catenin的累积在细胞核中，同时激活β-catenin/Tcf依赖的转录，促进细胞的上皮间质转化。于锋等[15]应用siRNA干扰β-catenin基因在喉癌Hep-2细胞中的表达，发现下调Hep-2细胞β-catenin基因表达可抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，促进肿瘤细胞的凋亡。本研究利用构建PDCD4-shRNA的质粒表达载体，转染Hep-2细胞，在细胞内转录生成shRNA，利用细胞内的Dicer酶，生成相应的siRNA, 发挥RNAi作用。下调Hep-2细胞PDCD4后，发现β-catenin基因在mRNA和蛋白水平均显著上调。β-catenin作为Wnt经典信号通路的重要下游元件，基因编码的蛋白分子量为92 kD，其表达水平与细胞的恶性表型密切相关。Wnt信号的异常激活引起胞浆内的β-catenin浓度升高，同时β-catenin从胞浆向细胞核内迁移，促进一系列下游基因如c-myc、cyclin D1等转录，从而调节细胞增殖分化等功能[16]。E-cadherin是一种跨膜蛋白，是上皮细胞的标志；β-catenin与E-cadherin胞内区结合形成复合体，后者与肌动蛋白骨架相连，从而减弱细胞间的黏附作用，最终诱导细胞的上皮间质转化，增加细胞的侵袭和迁移能力[17]。也就是说β-catenin在细胞的增殖、侵袭和迁移功能变化中都起到至关重要的作用。喉癌最常见病理类型为鳞状细胞癌，局部的浸润侵袭、颈部淋巴结转移、远处血行转移都提示预后不良。在喉癌的研究表明β-catenin高表达预示不良预后[18]。本研究中Hep-2细胞中PDCD4基因沉默后，β-catenin基因表达上调，而β-catenin基因表达上调一方面使得细胞的增殖能力增强，另一方面促进细胞上皮间质转化，说明在喉癌Hep-2细胞中β-catenin可能作为PDCD4基因的下游元件发挥作用。
综上所述，本研究成功筛选出针对PDCD4的有效干扰序列，转染PDCD4shRNA可有效沉默PDCD4基因在Hep-2细胞中的表达，应用实时定量RT-PCR、Western blotting 的方法进行干扰效果鉴定，获得沉默PDCD4基因在Hep-2细胞稳定株可以用于后续实验。本研究结果发现，沉默PDCD4基因在Hep-2细胞中的表达之后，细胞增殖能力明显提高，β-catenin表达上调。结合现有的研究表明，喉癌的PDCD4基因、β-catenin与细胞的增殖及上皮间质转化现象有着密切关系。然而PDCD4基因在Hep-2细胞上皮间质转化过程中如何起作用，其详细的分子机制仍需要进一步的实验研究证实。
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