山东大学耳鼻喉眼学报  2016, Vol. 30 Issue (5): 38-41  DOI: 10.6040/j.issn.1673-3770.0.2015.448
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高天喜, 夏翠, 闫静, 侯瑾, 康全清, 王正辉, 任晓勇. 间歇低氧模型大鼠肝脏组织中IGF-1、IGFBP-3的表达及分析[J]. 山东大学耳鼻喉眼学报, 2016, 30(5): 38-41.DOI: 10.6040/j.issn.1673-3770.0.2015.448.
GAO Tianxi , XIA Cui , YAN Jing , HOU Jin , KANG Quanqing , WANG Zhenghui , REN Xiaoyong . Analysis of IGF-1 and IGFBP-3 level in liver tissue of rat with intermittent hypoxia[J]. Journal of shandong eye ent, 2016, 30(5): 38-41. DOI: 10.6040/j.issn.1673-3770.0.2015.448.

基金项目

国家自然科学基金(30772404)

作者简介

高天喜. E-mail:tanghede@126.com。

通讯作者

侯瑾. E-mail:13319251982@126.com

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收稿日期：2015-10-27
网络出版时间：2016-05-24 15:04
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间歇低氧模型大鼠肝脏组织中IGF-1、IGFBP-3的表达及分析
高天喜, 夏翠, 闫静, 侯瑾, 康全清, 王正辉, 任晓勇     
西安交通大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科病院, 陕西 西安 710004
收稿日期：2015-10-27 ；网络出版时间：2016-05-24 15:04
基金项目：国家自然科学基金(30772404)
作者简介：高天喜. E-mail:tanghede@126.com。
通讯作者：侯瑾. E-mail:13319251982@126.com
摘要: 目的 检测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)间歇性低氧模型大鼠肝脏组织中IGF-I及IGFBP-3水平的变化, 探讨间歇低氧对肝脏的影响, 为研究儿童OSAHS的病理生理改变提供客观依据。 方法 24只雌性20日龄SD大鼠随机分为对照组、轻度低氧组、重度低氧组, 轻度低氧组、重度低氧组大鼠饲养于间歇性缺氧密闭箱内8 h/d。35 d后处死取材, 免疫组织化学法检测肝脏IGF-1、IGFBP-3。 结果 对照组、轻度低氧组、重度低氧组肝组织IGF-1的阳性表达分别为2/8、3/8和6/8, IGFBP-3的阳性表达分别为3/8、4/8和7/8, 有逐渐升高趋势。对照组与轻度低氧组肝组织IGF-1、IGFBP-3的表达差异无统计学意义。对照组与重度低氧组肝组织IGF-1、IGFBP-3的表达差异无统计学意义。Spearman秩相关检验表明, 重度低氧组中IGF-1与IGFBP-3的高表达呈正相关(r=0.746, P < 0.05)。 结论 间歇性低氧模型中大鼠肝细胞IGF-1与IGFBP-3含量受生长激素(GH)-IGF1-IGFBP3轴功能紊乱的影响不大, 重度低氧组大鼠肝细胞IGF-1与IGFBP-3含量与对照组及轻度低氧组比较无显著差异。
关键词: 胰岛素样生长因子-l    胰岛素样生长因子结合蛋白-3    肝脏    阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征    
Analysis of IGF-1 and IGFBP-3 level in liver tissue of rat with intermittent hypoxia
GAO Tianxi, XIA Cui, YAN Jing, HOU Jin, KANG Quanqing, WANG Zhenghui, REN Xiaoyong     
Department of Otolaryngology & Head and Neck Surgery, Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710004, Shaanxi, China
Abstract: Objective To detect the insulin-like growth factor 1(IGF-1) and insulin-like growth factors binding protein 3(IGFBP-3) levels in liver tissue of rat with intermittent hypoxia, and to investigate theeffect of intermittent hypoxia on liver, in order to provide pathophysiologic evidence of obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome (OSAHS) in chil-dren. Methods A total of 20 day-old Sprague-Dawley female rats were randomly divided into 3 groups:mild hypoxia group, severe hypoxia group and control group, the first two groups were raised in sealed hypoxia box 8-hour per day and were sacrificed 35 days after, The level of IGF-1 and IGFBP-3 of liver tissure was detected by immunohistochemi-cal method. Results The expression of IGF-1 and IGFBP-3 of liver in control group, mild hypoxia group and severe hypoxia group increased gradually.The positiveexpression rate of IGF-1 were 2/8, 3/8 and 6/8 in control group, low oxygen group and severe hypoxia group, respectively.The positiveexpression rate of IGFBP-3 were 3/8、4/8 and 7/8 in there group respectively.There was no significant difference in level of IGF-1 and IGFBP-3 between the control group and the mild hypoxia (χ2=0.157, P=0.315), and between the control group and thesevere hypoxia (χ2=0.066, P=0.132).Spearman-test showed a positive correlation between level of IGF-1 and IGFBP-3 in severe hypoxia group (r=0.746, P < 0.05). Conclusion GH-IGF1-IGFBP3axisdysfunctionhas little effect on IGF-1and IGFBP-3 in liver tissue of rate withintermittent hypoxia.There was no significant difference in level of IGF-1 and IGFBP-3 among three groups.
Key words: Insulin-likegrowth factorl    insulin-likegrowth factor binding protein-3    liver    obstructive sleep apnea-hypop-nea syndrome    

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(Obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS)是一种临床常见的儿童睡眠疾患[1]。如不积极采取治疗，睡眠呼吸暂停和低通气会不同程度地影响儿童的生长发育。目前，OSAHS影响儿童生长发育的机制尚不完全清楚。有学者提出胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)分泌异常与之密切相关[2]。血液中的IGF-1及IGFBP-3主要由肝脏合成分泌。2011年7月至2013年9月，我们采用儿童OSAHS间歇性低氧大鼠模型检测，研究间歇低氧与儿童生长发育密切相关的肝脏IGF-1、IGFBP-3水平的变化。

1 材料与方法 1.1 实验动物及分组

体质量(50±10)g的清洁级健康雌性20日龄SD大鼠24只[3]，由西安交通大学医学院动物实验中心提供，适应性喂养3 d。随机分为空白对照组(对照组)、轻度低氧组、重度低氧组共3组，各8只。

1.2 试剂

兔抗大鼠IGF-1多克隆抗体及兔抗大鼠IGFBP-3多克隆抗体购于Santa Cruz公司(工作浓度1:100)，PV-6001二步法试剂盒及DAB显色剂购于北京中杉金桥生物工程有限公司。

1.3 方法

轻度低氧组、重度低氧组大鼠每天8 h饲养于之前自行设计制造的自动控制间歇低氧试验箱内，此试验箱分为动物舱、过渡舱及缺氧舱3个舱，室温条件下大鼠直线往返3个舱内[3]。按照之前反复实验确定的条件进行实验，轻度低氧组大鼠在动物舱停留600 s，过渡舱2 s，低氧舱停留8 s；重度低氧组在动物舱停留150 s，过渡舱2 s，低氧舱停留8 s；当大鼠返回动物舱内时，2个组血氧饱和度(oxygensaturation, SaO2)均为98%～100%，使得实验大鼠血氧饱和度符合儿童OSAHS轻、重度标准[4]。对照组不做任何处理。各组大鼠饲养35 d后用固定液(含0.8％氯化钠，0.4％葡萄糖，20 mL肝素)通过主动脉灌注固定肝脏，取肝脏左叶做免疫组化检测IGF-I和IGFBP-3含量，采用PV二步法行免疫组织化学染色。

1.4 染色结果及判断标准

光镜下观察各组大鼠肝脏IGF-1和IGFBP-3免疫组化染色切片，并摄片。IGF-I、IGFBP-3主要在细胞浆、细胞膜上表达。显微镜下，均以出现棕黄色颗粒作为阳性细胞，无棕黄色颗粒则为阴性细胞。

1.5 统计学处理

数据应用SPSS 13．0进行统计，各组间IGF-1和IGFBP-3阳性率的比较采用Fisher确切概率法，相关性检验用非参数Spearman相关处理。检验水准α＝0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 IGF-1表达的比较

对照组、轻度低氧组、重度低氧组肝组织IGF-1的阳性表达分别为2/8、3/8和6/8，见表 1。对照组与轻度低氧组肝组织IGF-1的表达差异无统计学意义(χ2=0.157，P=0.315)(图 2，图 3)。对照组与重度低氧组肝组织IGF-1的表达差异无统计学意义(χ2=0.066，P=0.132)(图 2，图 4)。

表 1 IGF-1在各组大鼠肝脏中的表达 Table 1 Expression of IGF-1 in liver tissue
图 1 重度低氧组大鼠肝脏IGF-1免疫组织化学染色结果(×400) Figure 1 The immunohistochemical features of IGF-1 in liver tissue of rat in severe hypoxia group(×400)
图 2 轻度低氧组大鼠肝脏IGF-1免疫组织化学染色结果(×400) Figure 2 The immunohistochemical features of IGF-1 in liver tissue of rat in mild hypoxia group(×400)
图 3 对照组大鼠肝脏IGF-1免疫组织化学染色结果(×400) Figure 3 The immunohistochemical features of IGF-1 in liver tissue of rat in control group(×400)
图 4 重度低氧组大鼠肝脏IGFBP-3免疫组织化学染色结果(×400) Figure 4 The immunohistochemical features of IGFBP-3 in liver tissue of rat in severe hypoxia group(×400)
2.2 IGFBP-3表达的比较

对照组、轻度低氧组、重度低氧组肝组织中IGFBP-3的阳性表达率分别为3/8、4/8和7/8，见表 2。对照组与轻度低氧组肝组织IGFBP-3的表达差异无统计学意义(χ2=0.141，P=0.282)(图 5，图 6)。对照组与重度低氧组肝组织IGFBP-3的表达差异无统计学意义(χ2=0.059，P=0.119)(图 4，图 6)。

表 2 IGFBP-3在各组大鼠肝脏中的表达 Table 2 Expression of IGFBP-3 in liver tissue
图 5 轻度低氧组大鼠肝脏IGFBP-3免疫组织化学染色结果(×400) Figure 5 The immunohistochemical features of IGFBP-3 in liver tissue of rat in mild hypoxia group(×400)
图 6 对照组大鼠肝脏IGFBP-3免疫组织化学染色结果(×400) Figure 6 The immunohistochemical features of IGFBP-3 in liver tissue of rat in control group(×400)
2.3 IGF-1与IGFBP-3表达的比较

高倍镜下(400×)随机观察每个切片5个无重复区域视野，综合阳性细胞百分率和染色强度为判定标准，即阳性细胞数＜5％为(-)、5％～50％为(+)、＞50％～75％为(++)、>75％为(+++)，分别为0分、1分、2分、3分.无色为0分、浅黄色为1分、棕黄色为2分、深棕色3分，两种得分相加即为IGF-1与IGFBP-3在重度低氧组中的表达评分。采用Spearman秩相关检验，重度低氧组中IGF-1与IGFBP-3的高表达呈正相关关系(r=0.746，P＜0.05)，见表 3，图 7。

表 3 重度低氧组大鼠IGF-1、IGFBP-3评分表 Table 3 IGF-1、IGFBP-3 scale in severe hypoxia group
图 7 重度低氧组大鼠肝脏IGF-1、IGFBP-3相关关系示意图 Figure 7 Scatter diagram of IGF-1 and IGFBP-3 level in liver tissue of rats in severe hypoxia group
3 讨论

最新研究[5]发现，生长发育迟滞的儿童占OSAHS患儿高达50%，因此OSAHS对患儿生长发育的影响越发引起医学界的重视。但是，目前OSAHS影响儿童生长发育的机制尚不完全清楚。但是值得肯定的是，生长发育的调控与下丘脑-生长激素(GH)-IGF轴密不可分。GH有昼夜节律分泌特征，夜间慢波睡眠开始达到最高值。研究[6]认为，OSAHS儿童有睡眠碎片化，尤其存在慢波睡眠的减少[5]，这可能直接影响GH的分泌，而GH主要通过肝脏分泌的IGF-1、IGFBP-3间接发挥作用。

有研究[7]认为慢性低氧增加下丘脑室旁核生长激素释放抑制因子(SS)mRNA的表达，增加的SS直接导致GH分泌的减少。GH是IGF-1和IGFBP-3分泌的主要调控者，而且，IGF-1在血中主要与IGFBP-3结合，或再与不稳定的亚单位结合成三聚体，调节IGF-1的含量。GH缺乏症患儿血清IGF-1和IGFBP-3含量均明显低于正常儿童，且血清IGF-1和IGFBP-3含量与GH分泌峰值呈正相关[8]。从以上实验结果可以看出重度低氧组中肝脏IGF-1与IGFBP-3的高表达呈正相关关系，因此这些观点进一步支持本研究的肝组织IGF-1与IGFBP-3含量变化正相关的结论。

OSAHS模型的特征就是间断性低氧模型。有关于低氧模型的实验证明[9]，外周循环的IGF-1和IGFBP-3均降低，证明肝脏和/或其他组织释放入血液和组织中的IGF-1和IGFBP-3降低。间断性低氧导致GH分泌的减少，继而分泌减少的GH对大鼠组织细胞IGF-1的合成分泌刺激减少，导致大鼠组织细胞IGF-1 mRNA的表达下降[10]。

本研究结果显示，重度低氧组、轻度低氧组与对照组肝脏IGF-1和IGFBP-3的表达差异无统计学意义。我们认为可能原因有以下几方面：第一，间断性低氧对肝脏分泌IGF-1和IGFBP-3的影响可能不大，血液中的IGF-1和IGFBP-3并不只是来源于肝脏，其他组织也可以分泌释放IGF-1和IGFBP-3。可能间断性缺氧还可通过影响其他组织，并使这些组织减少IGF-1和IGFBP-3分泌的途径，引起血清中IGF-1和IGFBP-3水平的降低，从而影响生长发育。第二，OSAHS影响儿童生长发育可能与GH-IGF1-IGFBP3轴紊乱以外的其他病理生理过程有关，也可能与实验样本量偏小有关。这就提示我们在以后的实验中加大样本量，来进一步研究间断缺氧对生长发育影响的机制。

参考文献
[1] Waters K A, Everett F, Bruderer J, et al. The use of nasal CPAP in children[J]. Pediatr Pulmonol Suppl , 1995, 11 : 91–93.
[2] Blum W F, Albertsson-Wikland K, Rosberg S, et al. Serum levels of insulin-like growth factor I (IGF-I) and IGF binding protein 3 reflect spontaneous growth hormone secretion[J]. J Clin Endocrinol Metab , 1993, 76 (6) : 1610–1616.
[3] 闫静, 侯瑾, 盛颖, 等. 间歇性缺氧大鼠模型的建立及评价[J]. 山东大学学报(医学版) , 2013, 51 (6) : 53–56.
YAN Jing, HOU Jin, SHENG Ying, et al. Establishment and evaluation of an intermittent hypoxia animal model in the rat[J]. J Shandong Univ (Health Sciences) , 2013, 51 (6) : 53–56.
[4] 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编委会, 中华医学会耳鼻咽喉科学分会. 儿童阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征诊疗指南草案(乌鲁木齐)[J]. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志 , 2007, 42 (2) : 83–84.
[5] Brouillette R T, Fernbach S K, Hunt C E. Obstructive sleep apnea in infants and children[J]. J Pediatr , 1982, 100 (1) : 31–40. DOI:10.1016/S0022-3476(82)80231-X
[6] Blum W F, Albertsson-Wikland K, Rosberg S, et al. Serum levels of insulin-like growth factor I (IGF-I) and IGF binding protein 3 reflect spontaneous growth hormone secretion[J]. J Clin Endocrinol Metab , 1993, 76 (6) : 1610–1616.
[7] Xu N Y, Chen X Q, Du J Z, et al. Intermittent hypoxia causes a suppressed pituitary growth hormone through somatostatin[J]. Neuro Endocrinol Lett , 2004, 25 (5) : 361–367.
[8] 欧阳士香, 白东. 生长激素缺乏症患儿血清胰岛素样生长因子-1及其结合蛋白的变化[J]. 实用儿科临床杂志 , 2003, 18 (8) : 605–606.
OUYANG Shixiang, BAI Dong. The diagnosis value of the serum insulin-like growth factor-1, insulin-like growth factor binding protein-3 of children with growth hormone dificient[J]. J Applied Clinical Pediatrics , 2003, 18 (8) : 605–606.
[9] 侯瑾, 闫静, 康全清. 间歇缺氧对幼龄大鼠血清中胰岛素样生长因子水平的影响[J]. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志 , 2012, 47 (3) : 218–222.
HOU Jin, YAN Jing, KANG Quanqing. Study on intermittent hypoxia in children sleep apnea hypopnea syndrome model and insulin-like growth factor-1 and insulin-like growth factor binding protein-3 levels in serum[J]. Chin J Otorhinolarynol Head Neck Surg , 2012, 47 (3) : 218–222.
[10] Chen X Q, Du J Z. Increased somatostatin mRNA expression in periventricular nucleus of rat hypothalamus during hypoxia[J]. Regul Pept , 2002, 105 (3) : 197–201. DOI:10.1016/S0167-0115(02)00022-8