2017, Vol. 31
2. 苏州大学附属第二医院，睡眠中心，江苏 苏州 215004
2. Sleep Center, the Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, Jiangsu, China
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征 (obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS) 是一种常见的睡眠障碍疾病，其主要病理生理过程是夜间睡眠过程中由于气道塌陷引起的反复低氧/再氧合及睡眠结构紊乱，这也是引起认知功能障碍的最为关注的原因[1]。该过程类似于缺血再灌注，产生了过多的氧自由基，破坏了氧化系统和抗氧化系统的平衡，导致氧化应激的发生[2]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferater-activated receptor gamma, PPARγ) 是配体激活的转录因子核激素受体超家族之一，被激活后转移至细胞核内，从而发挥对目的基因的调控作用。以往多项研究表明, PPARγ通过其受体激动剂来发挥抗氧化应激[3-4]功能，并且具有改善认知功能的作用[3, 5]。罗格列酮 (Rosiglitazone, ROS) 为PPARγ的人工合成配体, 是PPARγ强有力的外源性激动剂，目前尚无有关PPARγ激动剂在间歇性低氧 (intermittent hypoxia, IH) 方面的干预研究。本实验以IH模型模拟OSAHS发病机制，研究该状态下PPARγ激剂罗格列酮对小鼠氧化应激及认知功能方面的作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物健康清洁级ICR雄性幼鼠60只 (3~4周龄), 体质量15~20 g, 由苏州大学实验动物中心提供，合格证号: SYXK (苏) 2012-0045。
1.2 实验仪器及主要试剂IH装置 (专利号:CN201257016):苏州大学附属第二医院睡眠中心与天津合普工贸有限公司共同设计, 由有机玻璃低氧舱 (规格为r=20 cm, h=15 cm)、压缩空气机、电脑控氧仪、氮气源、气体传输管道等部分组成；Morris水迷宫 (上海吉量科技有限公司)；12号55 mm直灌胃针；盐酸吡格列酮由江苏德源药业股份有限公司提供 (批号:15122252)，临用时用生理盐水 (中国大冢制药有限公司) 溶解成不同浓度梯度 (9.11 mg/kg为按单位体表面积换算的小鼠可使用的临床最大推荐剂量)；丙二醛 (malondialdehyde，MDA) 测试试剂盒购自R & D公司，SOD测试试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.3 实验方法 1.3.1 实验动物饲养及分组所有的小鼠均喂以同样的干饲料, 饮用普通水, 室温控制在21~22 ℃，相对湿度50%~70%，适应性饲养7 d以适应新环境。将60只小鼠采用随机数字法，分为常氧对照组 (UC组，12只)、单纯间歇性低氧组 (IH组，12只)、低剂量罗格列酮干预组 (1 mg/kg ROS+IH组，12只)、中剂量罗格列酮干预组 (3 mg/kg ROS+IH组，12只) 及高剂量罗格列酮干预组 (9 mg/kg ROS+IH组，12只)。
1.3.2 动物模型制备每日于造模开始前30 min分别给予1 mg/kg ROS+IH组、3 mg/kg ROS+IH组、9 mg/kg ROS+IH组1 mg/kg，3 mg/kg，9 mg/kg的吡格列酮灌胃 (为保证灌胃量的准确，每周称质量一次)，而UC组及IH组给予等量生理盐水灌胃作为对照。IH组及罗格列酮灌胃处理后的各组小鼠置于间歇性低氧舱内，通过间断充入氮气及压缩空气，每60 s做一次缺氧/再氧合循环，使氧浓度波动在6%~8%和20%~21%之间，每天8 h, 共4周，其中1 mg/kg ROS+IH组及3 mg/kg ROS+IH组各有一只小鼠在造模过程中死亡。
1.3.3 取材于4周造模结束后, 动物分为两批，每组分别随机取6只小鼠为第一批，并使用摘眼球取血法采血0.8~1 mL, 4 ℃离心机1 000×g 10 min离心后取血清成分, 并快速于-80 ℃冰箱冻存, 待检测各项指标。
1.3.4 检测小鼠血清中MDA及SOD浓度使用MDA及SOD测定试剂盒严格按照说明书进行。
1.3.5 水迷宫行为学检测于4周造模结束后，取每组剩余的小鼠，参照文献[6]进行水迷宫检测小鼠学习记忆功能。包括定位航行及空间探索实验，前5 d进行定位航行实验。每天训练4次，历时5 d。每次小鼠随机从四个不同象限面向池壁放入水中，观察并记录小鼠寻找并爬上平台所需时间 (逃避潜伏期)，取四个象限平均值作为当日成绩。如90 s仍未找到平台，由操作者将小鼠引上站台休息15 s，并将逃避潜伏期记为90 s。第6天进行空间探索实验，以任意一点为入水点，记录小鼠在90 s内穿过原平台区域的次数和在原平台象限内游泳时间占整个时间的百分比。
1.4 统计学处理计量数据以x±s表示，采用SPSS 22.0软件进行统计分析，不同组间数据比较均采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。检验水准α=0. 05。P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组小鼠血清中MDA及SOD浓度间歇性低氧4周后，IH组小鼠MDA浓度较UC组高, SOD浓度较UC组低 (P < 0.05)；与UC组相比，使用吡格列酮干预的1 mg/kg ROS+IH组、3 mg/kg ROS+IH组、9 mg/kg ROS+IH组，随着吡格列酮浓度的升高, 小鼠血清MDA及SOD浓度有剂量依赖性改变的趋势，见表 1。
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表 1 各组小鼠血清MDA浓度 (x±s) Table 1 The MDA concentration in each group (x±s) |
间歇性低氧4周后，相较于UC组，IH组平均逃避潜伏时间延长，寻找平台时间变长，穿越平台次数减少及在平台象限所占时间百分比降低，差异均有统计学意义，说明间歇性低氧处理后，小鼠学习记忆功能减退。相较于IH组，高剂量罗格列酮干预治疗的9 mg/kg ROS+IH组平均逃避潜伏时间变短，穿越平台次数增多及在平台象限所占时间百分比增大，差异均有统计学意义，而1 mg/kg ROS+IH组、3 mg/kg ROS+IH组相较于IH组逃避潜伏时间，寻找平台能力亦有改善趋势, 说明罗格列酮干预处理后的间歇性低氧小鼠学习记忆功能有所改善, 见表 2。
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表 2 各组水迷宫检测结果 (x±s) Table 2 Morris water maze test result in each group (x±s) |
慢性间歇性低氧作为OSAHS的病理生理特点，可诱导机体产生过多的活性氧自由基，进而改变机体内促氧化与抗氧化两系统之间的平衡，导致氧化应激的发生[7-8]，并可以导致多器官、多系统功能障碍，对神经系统的损害尤为严重。本实验以慢性间歇性低氧模型模拟OSAHS的发病过程。既往实验证实该模型造模4周的间歇性低氧小鼠能够出现氧化应激损伤[9]及认知功能障碍[10]。本实验在此基础上，进一步探讨PPARγ激动剂罗格列酮对间歇性低氧处理的小鼠氧化应激及认知功能的作用。PPARγ可表达于脾脏、肝脏、骨髓、睾丸、骨骼肌、脑组织、脂肪组织等组织及多种细胞，其表达位置的多样性决定着其功能的多样性。PPARγ受体激动剂作为体内有效的抗氧化剂可通过抑制脂质过氧化反应，增强机体清除自由基及细胞抵抗缺氧损伤的能力[3, 12]。早期研究发现，PPARγ激活对神经细胞的氧化应激损伤具有保护作用[11]。在大鼠海马缺血再灌注实验模型中, PPARγ激动剂干预的实验组，大鼠氧自由基减少、脂质过氧化反应产物增加, SOD和NF-κB活性减弱, 通过抑制炎症反应和氧化应激反应, 发挥对大脑缺血再灌注损伤的保护作用[13]。在癫痫鼠模型中, 罗格列酮能通过抑制炎症反应, 减少神经细胞凋亡及抑制氧化活性物质产生, 抑制脂质过氧化反应，发挥神经保护作用[11]。近年来也有研究证实，PPARγ激动剂在小鼠耳蜗基底膜螺旋神经节神经节氧化损伤具有保护作用[14]，并且能够改善H2O2诱导的原代皮质神经元损伤[15]。虽然已有大量研究证实PPARγ激动剂在多个领域、多个水平具有抗氧化应激损伤及神经保护作用，但在IH方面尚无干预研究。本实验建立IH模型并使用不同梯度的PPARγ激动剂罗格列酮予以干预，在血清氧化应激指标及行为学上研究其作用。
本实验中，相较于UC组，IH组MDA浓度升高，SOD浓度降低与既往研究相符[9]；相较于IH组, 罗格列酮干预后的各组小鼠的血清MDA浓度呈剂量依赖性的降低，SOD浓度升高。MDA为脂质过氧化反应的主要代谢产物，对氧化应激的变化较为敏感，SOD是细胞内的天然抗氧化剂，是目前常用的代表氧化应激水平的指标。该实验结果说明PPARγ激动剂罗格列酮能够改善IH所致的氧化应激。有学者研究表明[3]，PPARγ激动剂罗格列酮能通过上调PPARγ的表达来改善癫痫大鼠氧化应激水平。罗格列酮灌胃处理的大鼠，其超氧阴离子自由基对生物膜中的多价不饱和脂肪酸的攻击减弱，脂质过氧化反应减弱，脂质过氧化物减少，所以MDA含量降低，超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、NO含量均升高[16]。而过氧化氢酶、SOD基因包含了PPRE[18], 配体可以通过激活PPARγ、活化PPARγ与PPRE相互作用，调节基因转录和翻译等生物学效应发挥作用。该实验中，PPARγ可能通过与过氧化氢酶、SOD基因上游PPRE结合上调抗氧化酶, 抑制氧化应激反应，导致脂质过氧化减轻，使得罗格列酮处理后的小鼠氧化应激水平降低，具体机制尚需进一步研究。
此外，相较于UC组，IH组的小鼠逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少及在平台象限所占时间百分比降低，说明IH能导致认知功能障碍。相较于IH组, 经高剂量PPARγ激动剂治疗后的小鼠逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多及在平台象限所占时间百分比增大，差异有统计学意义。说明PPARγ激动剂罗格列酮能够改善IH所致的认知功能障碍。中枢神经组织脂质成分较多，抗氧化酶相对缺乏、耗氧量高，因此IH时中枢神经组织对自由基损伤特别敏感，对氧化应激具有独特的易损性，易造成脑损伤及海马等处神经细胞凋亡，从而引起认知功能损害, 这也与既往研究相符[8, 10]。罗格列酮可能通过抑制炎症反应、减少细胞凋亡、抗氧化作用等机制发挥脑保护作用[19]。IH导致认知功能障碍可能与Caspase-3等介导的海马神经元细胞凋亡及突触可塑性改变的发生相关[10]。一方面，罗格列酮可通过调节细胞分化和凋亡等[15], 下调Caspase-3和Bax等凋亡基因，上调脑保护蛋白热休克蛋白-27(hotShockProtein-27, HSP-27)、HSP-70、HSP-32和SOD、过氧化氢酶等的表达发挥改善认知功能的作用[20]。另一方面，罗格列酮也可能通过降低海马组织糖原合成酶激酶-3β及细胞外信号调节激酶的活性，从而减少海马神经元丢失及突触结构的损伤，来达到改善认知功能的作用[21]。罗格列酮可以通过直接作用或通过改善氧化应激的间接作用来改善认知功能。
综上，间歇性低氧能够引起小鼠氧化应激及认知功能障碍，而PPARγ激动剂罗格列酮具有改善间歇性低氧引起的氧化应激及认知功能障碍的作用。PPARγ可以作为OSAHS引起的氧化应激损伤及认知功能障碍治疗的潜在干预靶点。
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