慢性鼻-鼻窦炎或简称慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis，CRS)，是指病程超过12周的鼻窦与鼻腔黏膜的慢性炎症，是鼻科学领域长期所关注的焦点问题。临床上将其分为不伴鼻息肉的慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis without nasal polyps,CRSsNP)和伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP)^[1]。2012年欧洲慢性鼻窦炎和鼻息肉意见书将伴有哮喘的CRSwNP定义为难治性鼻窦炎。慢性鼻窦炎其发病与多种因素有关，其病因学和发病机制十分复杂，迄今为止，引起CRS发病的关键环节(如变态反应、细菌超抗原、细菌生物膜等的作用)尚不明确。

自噬(Autophagy)是机体一种重要的保护和防御机制，在机体维持内稳态和适应微环境改变的过程中发挥着非常重要的作用。在不同的情况下，细胞自噬既可以保护细胞，也可以促进细胞死亡，因此在不同疾病中、甚至相同疾病的不同时期中，细胞自噬可能发挥着完全不同的作用^[2]。近年来研究认为，鼻腔、鼻窦黏膜与呼吸道黏膜不仅相互延续，而且存在多方面的相互作用和影响，而且越来越多的研究证明细胞自噬在多种呼吸系统疾病(如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤、囊性纤维病等)的发病过程中起着重要的调控作用，而自噬在CRS起病过程中作用的研究仍处于空白。本实验拟通过研究自噬相关基因Atg3、Ambra1在CRSsNP、CRSwNP及CRSwNP伴哮喘患者鼻腔黏膜中的表达，探讨自噬与CRS及哮喘的相互关系以及可能的作用机制。

标本取自2014年11月至2015年9月山东大学齐鲁医院住院患者。依据我国2012年昆明CRS诊断指南，根据患者临床症状、体征、鼻窦CT检查、鼻内镜检查及术后病理检查作出诊断。选取21例(其中男13例，女8例，21～61岁，平均37.4岁)CRSsNP患者、22例(其中男12例，女10例，22～71岁，平均43.2岁)CRSwNP患者、18例(其中男10例，女8例，32～63岁，平均46.4岁)CRSwNP伴发哮喘患者鼻腔黏膜为实验组，所有实验组鼻腔黏膜均取自患侧窦口鼻道复合体,除外息肉样变黏膜。CRSwNP伴发哮喘患者根据既往病史确诊为轻度或中度哮喘，术前经我院肺功能及呼吸科其他检查诊断为哮喘症状完全控制3个月以上的患者。收集24例(其中男16例，女8例，16～48岁，平均29.6岁)鼻中隔偏曲患者的下鼻甲黏膜为对照组，均经鼻窦CT检查排除鼻窦炎症。

患者既往均无鼻部手术史，术前1个月内均未使用过抗菌类药物或含糖皮质激素类药物。所有患者排除免疫缺陷病及其他严重全身性疾病史；排除高血压、高脂血症及糖尿病病史；排除支气管扩张病史及肺囊性纤维化病史；排除冠心病及肿瘤病史。

各组患者之间的年龄构成差异(F=2．79，P=0.177)和性别构成差异(χ²=1.282，P=0.733)均无统计学意义。本实验经医学伦理委员会批准，患者均知情并签署知情同意书。

抗Atg3单克隆抗体和抗Ambra1多克隆抗体来自美国abcam公司；免疫组织化学试剂盒-兔/鼠通用型Streptavidin-HRP试剂盒(带DAB显色液)购自康为世纪公司；苏木素、伊红工作液购自上海碧云天生物技术有限公司。

新鲜标本离体后均用生理盐水反复冲洗，清洗干净表面残留血液及黏液后，立即完整浸泡于10%甲醛溶液中。

本实验以SABC法进行免疫组织化学染色。将10%甲醛溶液浸泡处理过后的实验标本经脱水透明、浸蜡包埋处理后，切片机连续切片，制成约4 μm厚度的石蜡切片。将石蜡切片60 ℃拷片1.5 h，经脱蜡水化，置入枸橼酸盐缓冲液微波加热修复20 min，再依次经过内源性过氧化物酶封闭液封闭及封闭用正常山羊血清工作液封闭，加入适量稀释后的一抗4 ℃孵育过夜(抗Atg3单克隆抗体工作浓度为1:200；抗Ambra1多克隆抗体工作浓度为1:200)；次日再依次经生物素标记羊抗兔/鼠二抗工作液及HRP标记链霉亲和素孵育，再经二氨基联苯胺(DAB)显色、苏木素复染、自来水返蓝、乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封片，最后显微镜下观察拍照。以磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)代替一抗作为阴性对照，以排除非特异性染色。

切片均由两位病理科医生独立双盲阅片，根据切片中染色强度和阳性染色细胞所占比值不同进行评分。自噬相关基因Atg3和Ambra1免疫组织化学染色阳性时表现为细胞质呈黄色-棕褐色。①染色强度评分：100倍显微镜下观察，无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;②阳性染色细胞所占比值评分：每张切片于400倍显微镜下选取10个不同的上皮细胞富集的视野，计数阳性染色细胞所占比值： < 5%记为0分，5%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，>75%记为4分;③以染色强度评分及阳性染色细胞所占比值评分相加记为免疫组化染色评分;④免疫组化染色评分以0～1分记为阴性(-)，2～3分记为弱阳性(+)，4～5分记为阳性(++)，6～7分记为强阳性(+++)，分别计数每个等级患者例数。以++～+++记为高表达，所占比率为高表达率。

采用SPSS 21.0软件，所有等级资料采用Kruskal-Wallis秩和检验进行总体分析，各组之间两两比较采用Mann-Whitney U检验进行分析，关联性分析采用Spearman相关分析法。P < 0.05认为差异有统计学意义。

Atg3、Ambra1蛋白均主要表达在细胞质中，呈黄色或棕褐色，强阳性时细胞膜及细胞间质也可染色(图 1、2)。

图1(Fig. 1)

图1 Atg3在各组中的表达情况(免疫组化,×400) A:Atg3在对照组下鼻甲黏膜中表达情况(-);B:Atg3在CRSsNP组黏膜中表达情况(+);C:Atg3在CRSwNP组黏膜中表达情况(++);D:Atg3在CRSwNP伴哮喘组黏膜中表达情况(+++)。 Fig. 1 The expression of Atg3 in each group (immunohistochemical staining,×400) A:The expression of Atg3 in the mucosa membrane tissue of inferior turbinate of control group (-);B:The expression of Atg3 in the mucosa membrane tissue of CRSsNP group (+);C:The expression of Atg3 in the mucosa membrane tissue of CRSwNP group (++);D:The expression of Atg3 in the mucosa membrane tissue of CRSwNP accompanied with asthma group (+++).

图2(Fig. 2)

图2 Ambra1在各组中的表达情况(免疫组化,×400) A:Ambra1在对照组下鼻甲黏膜中表达情况(+);B:Ambra1在CRSsNP组黏膜中表达情况 (++);C:Ambra1在CRSwNP组黏膜中表达情况(++);D:Ambra1在CRSwNP伴哮喘组黏膜中表达情况(+++)。 Fig. 2 The expression of Ambra1 in each group (Immunohistochemical staining,×400) A:The expression of Ambra1 in the mucosa membrane tissue of inferior turbinate of control group (+);B:The expression of Ambra1 in the mucosa membrane tissue of CRSsNP group (++);C:The expression of Ambra1 in the mucosa membrane tissue of CRSwNP group (++);D:The expression of Ambra1 in the mucosa membrane tissue of CRSwNP accompanied with asthma group (+++).

Atg3在对照组、CRSsNP组、CRSwNP组、CRSwNP伴哮喘组中高表达率逐渐升高，在各组之间的表达差异有统计学意义(χ²=31.080，P < 0.001)(表 1)。进一步两两比较，结果显示：Atg3在对照组与CRSsNP组之间(P=0.002)、对照组与CRSwNP组之间(P < 0.001)、对照组与CRSwNP伴哮喘组之间(P < 0.001)、CRSsNP组与CRSwNP伴哮喘组之间(P=0.002)、CRSwNP组CRSwNP伴哮喘组之间(P=0.024)表达差异均有统计学意义，但在CRSsNP组与CRSwNP组之间(P=0.304)表达差异无统计学意义(表 2)。

表1(Tab. 1)

表1 Atg3免疫组织化学染色结果 Tab. 1 Atg3 results in immunohistochemical staining 组别 n 各等级免疫组织化学染色评分 高表达率(%) ++～+++ - + ++ +++ 对照组 24 12 10 2 0 8.33 CRSsNP组 21 3 9 9 0 42.86 CRSwNP组 22 2 8 10 2 54.55 CRSwNP伴 哮喘组 18 0 4 7 7 77.78

表1 Atg3免疫组织化学染色结果 Tab. 1 Atg3 results in immunohistochemical staining

表2(Tab. 2)

表2 Atg3在各组之间两两比较 Tab. 2 Atg3 results in pairwise comparisons 两组之间比较 Z值 P值 对照组与CRSsNP组 -3.067 0.002 对照组与CRSwNP组 -3.767 < 0.001 对照组与CRSwNP伴哮喘组 -4.781 < 0.001 CRSsNP组与CRSwNP组 -1.027 0.304 CRSsNP组与CRSwNP伴哮喘组 -3.094 0.002 CRSwNP组与CRSwNP伴哮喘组 -2.254 0.024

表2 Atg3在各组之间两两比较 Tab. 2 Atg3 results in pairwise comparisons

Ambra1在对照组、CRSsNP组、CRSwNP组、CRSwNP伴哮喘组中高表达率逐渐升高，在各组间表达差异有统计学意义(χ²=33.000，P < 0.001)(表 3)。进一步两两比较，结果显示：Ambra1在对照组与CRSsNP组之间(P=0.009)、对照组与CRSwNP组之间(P < 0.001)、对照组与CRSwNP伴哮喘组之间(P < 0.001)、CRSsNP组与CRSwNP伴哮喘组之间(P < 0.001)、CRSwNP组与CRSwNP伴哮喘组之间(P=0.009)表达差异均有统计学意义，在CRSsNP组与CRSwNP组之间(P=0.205)表达差异无统计学意义(表 4)。

表3(Tab. 3)

表3 Ambra1免疫组织化学染色结果 Tab. 3 Ambra1 results in immunohistochemical staining 组别 n 各等级免疫组织化学染色评分 高表达率(%) ++～+++ - + ++ +++ 对照组 24 9 10 5 0 20.83 CRSsNP组 21 2 8 10 1 52.38 CRSwNP组 22 1 6 12 3 68.18 CRSwNP伴 哮喘组 18 0 1 8 9 94.44

表3 Ambra1免疫组织化学染色结果 Tab. 3 Ambra1 results in immunohistochemical staining

表4(Tab. 4)

表4 Ambra1在各组之间两两比较 Tab. 4 Ambra1 results in pairwise comparisons 两组之间比较 Z值 P值 对照组与CRSsNP组 -2.612 0.009 对照组与CRSwNP组 -3.587 < 0.001 对照组与CRSwNP伴哮喘组 -4.894 < 0.001 CRSsNP组与CRSwNP组 -1.266 0.205 CRSsNP组与CRSwNP伴哮喘组 -3.663 < 0.001 CRSwNP组与CRSwNP伴哮喘组 -2.798 0.009

表4 Ambra1在各组之间两两比较 Tab. 4 Ambra1 results in pairwise comparisons

采用Spearman相关分析法分析各组中Atg3免疫组化染色评分与Ambra1免疫组化染色评分的关联性。结果显示：Atg3基因和Ambra1基因在CRSsNP组(r=0.619，P=0.003)、CRSwNP组(r=0.392，P=0.022)和CRSwNP伴哮喘组(r=0.552，P=0.033)中表达呈正相关性，在对照组中无相关性(r=0.316，P=0.133)(表 5)。

表5(Tab. 5)

表5 各组中Atg3基因与Ambra1基因表达的相关性 Tab. 5 Correlation between the expressions of Atg3 and Ambra1 in each group 组别 例数 r值 P值 对照组 24 0.316 0.133 CRSsNP组 21 0.619 0.003 CRSwNP组 22 0.392 0.022 CRSwNP伴哮喘组 18 0.552 0.033

表5 各组中Atg3基因与Ambra1基因表达的相关性 Tab. 5 Correlation between the expressions of Atg3 and Ambra1 in each group

CRS是鼻腔及鼻窦慢性炎症性疾病，是耳鼻咽喉科常见病。该病不仅严重影响患者的生活质量，还造成巨大的社会经济负担。临床显示CRS的发生与哮喘的发生及其严重程度密切相关，超过2/3患有严重哮喘的患者同时患有鼻窦疾病。目前对CRS发病机制存在多种假说，如细菌超抗原、变态反应、细菌生物膜、局部解剖学异常等，但是具体的发病机制仍有待进一步研究。

细胞自噬是机体内一种依赖溶酶体酶的降解过程，具有高度保守性；它是机体的一种保持自身稳态、适应周围微环境的重要免疫防御机制^[3]。正常情况下，细胞保持较低程度的基础自噬水平。应激状态下，自噬水平被迅速上调。一方面细胞自噬可以保持细胞活性，促进细胞生存，增加细胞寿命；但另一方面，在特定环境下，自噬可以导致细胞内细胞器和大分子物质的大量消耗，最终致使细胞死亡。因此自噬在不同疾病的不同阶段可能发挥着截然不同的作用。在某些疾病中，抑制自噬导致疾病加重；而某些疾病与之相反，自噬的激活导致疾病的发生发展。目前已有大量研究表明：细胞自噬在一些肿瘤、免疫、炎症、感染、心血管疾病等发展过程中有着非常重要的调控作用。

细胞自噬过程是一种非常复杂的过程，受多种基因和蛋白的严格调控，我们把这些基因统称为Atg家族(autophagy-related genes)^[4]。细胞自噬激活依赖于两个泛素结合系统，一是Atg8结合系统，二是Atg12-Atg5结合系统^{[5, 6]}。Atg3是Atg8结合系统重要调控基因，在其中主要起E2-同源酶的作用，参与自噬过程的调节。此外，细胞自噬还存在两个关键的酶系统，第一激酶为Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(ⅢPl3-kinase)；第二个激酶为丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶复合物。Ambra1是近几年新发现的一个自噬相关基因^[7]，通过参与ⅢPl3-kinase复合物的形成调节自噬过程。

本实验结果中发现，Atg3和Ambra1在CRSsNP组、CRSwNP组、CRSwNP伴哮喘组中的表达呈正相关性(P < 0.05)，表明Atg3与Ambra1在CRS疾病的发生发展过程中可能起相互协作的关系，但具体作用机制不明确。综上所述，可以将ATG3和Ambra1在组织中表达的强弱视为细胞自噬水平强弱。

细胞自噬与炎症反应的产生都是机体对外界刺激的响应，调控炎症的信号通路能够调节细胞自噬，反之亦然。炎症反应的引发主要通过固有免疫系统利用toll样受体(toll-1ike receptor，TLR)等受体识别外源性或内源性配体导致受体活化，继而分泌促炎因子，从而激活适应性免疫应答^[8]。近年有研究显示，多种TLR的配体在激活炎症反应的同时诱导细胞自噬的产生。而细胞自噬对TLR信号及炎症反应有明显的负向调控作用，能调控炎症小体的激活并且限制炎性细胞因子IL-β和IL-18的产生。细胞自噬与炎性疾病的发生关系密切，自噬和炎症两个系统之间相互影响，在多种应激条件下保持动态平衡^[9]本实验中Atg3与Ambra1在CRSsNP组以及CRSwNP伴哮喘组黏膜中表达均高于对照组，表明细胞自噬与CRS疾病的发生发展密切相关。

越来越多的研究表明：细胞自噬可能参与哮喘的发病过程，如通过影响Thl、Th2分化及平衡，介导慢性气道炎症；通过调节哮喘相关病原体的增殖、活性及炎症反应；Poon等^[10]的研究证明：自噬相关基因ATG5的遗传多态性与哮喘密切相关。有相关实验证实在动物实验中，自噬相关基因LC3B敲除后能明显缓解哮喘气道炎症^[11]。本实验中Atg3与Ambra1在CRSwNP伴哮喘组黏膜中表达高于CRSwNP组、CRSsNP组及对照组，说明细胞自噬可能参与CRS患者哮喘的发生。

目前没有自噬相关基因与CRS相关关系的报道。本实验采用免疫组织化学染色方法观察自噬相关基因Atg3和Ambra1在CRS黏膜中的表达，结果表明Atg3与Ambra1在CRS疾病的发生发展过程中可能起相互协作的关系，细胞自噬的上调与CRS疾病的发生发展密切相关，细胞自噬可能参与CRS患者哮喘的发生，但自噬参与CRS疾病调控的具体分子机制尚不明确。随着对自噬研究的不断深入，这可能为CRS疾病的诊断和治疗提供新的研究方向。