山东大学耳鼻喉眼学报  2016, Vol. 30 Issue (3): 52-55  DOI: 10.6040/j.issn.1673-3770.0.2015.308
0

引用本文 

常江沂, 马玲国, 李建裕, 周敬淳, 周舟, 曾凡倩, 徐杨. 异种(牛)脱细胞真皮基质-游离空肠复合体构建实验研究[J]. 山东大学耳鼻喉眼学报, 2016, 30(3): 52-55.DOI: 10.6040/j.issn.1673-3770.0.2015.308.
CHANG Jiangyi , MA Lingguo , LI Jianyu , ZHOU Jingchun , ZHOU Zhou , ZENG Fanqian , XU Yang . Experimental study on the construction of heterogeneous decellularized dermal matrix-free jejunal complex.[J]. Journal of Otolaryngology and Ophthalmology of Shandong University, 2016, 30(3): 52-55. DOI: 10.6040/j.issn.1673-3770.0.2015.308.

基金项目

深圳市科技计划项目(201202131)

作者简介

常江沂。E-mail：changjhiangyi2015@sohu.com。

通讯作者

马玲国。E-mail：ljymax@163.com

文章历史

收稿日期：2015-07-26
网络出版时间：2016-03-31
目录              摘要              全文              图/表              PDF
异种(牛)脱细胞真皮基质-游离空肠复合体构建实验研究
常江沂, 马玲国, 李建裕, 周敬淳, 周舟, 曾凡倩, 徐杨     
深圳市人民医院/暨南大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科，广东 深圳 518020
收稿日期：2015-07-26 ；网络出版时间：2016-03-31
基金项目：深圳市科技计划项目(201202131)
作者简介：常江沂。E-mail：changjhiangyi2015@sohu.com。
通讯作者：马玲国。E-mail：ljymax@163.com
摘要: 目的 研究异种(牛)脱细胞真皮基质-游离空肠复合体的构建技术，以期解决游离空肠移植重建长段气管术后肠腺分泌的问题。 方法 选择10只杂种犬，制备去上皮游离空肠段，将剪成合适大小的异种(牛)脱细胞真皮基质覆盖于游离空肠基底膜表面，并用覆膜镍钛合金支架支撑固定，将构建好的复合体移至腹膜外与腹部皮肤之间，分别于术后7 d、14 d、1个月、3个月和6个月后取出，查看复合体的生长情况。 结果 10只实验犬中，有1只因肠粘连和伤口感染死亡而未能完成实验，余9只实验犬术后存活良好。术后7 d、14 d肉眼观察和病理检查,在游离空肠内表面均见有异种(牛)脱细胞真皮基质成分，表面黏膜层可见部分鳞状上皮化生；术后1个月、3个月、6个月肉眼和病理检查均未再发现异种(牛)脱细胞真皮基质成分，游离空肠内表面几乎全部化生为复层鳞状上皮。 结论 合适大小的异种(牛)脱细胞真皮基质覆盖在去上皮游离空肠内表面，可以促进游离空肠内表面的鳞状上皮化生，抑制肠腺分泌。覆膜镍钛记忆合金支架有一定的弹性，可以很好的对异种(牛)脱细胞真皮基质-去上皮游离空肠复合体起到支撑固定作用。
关键词: 动物实验    气管重建    游离空肠    异种(牛)脱细胞真皮基质    抑制    肠腺分泌    
Experimental study on the construction of heterogeneous decellularized dermal matrix-free jejunal complex.
CHANG Jiangyi, MA Lingguo, LI Jianyu, ZHOU Jingchun, ZHOU Zhou, ZENG Fanqian, XU Yang     
Department of Otolaryngology & Head and Neck Surgery, Shenzhen People's Hospital/Second Clinical College of Jinan University, Shenzhen 518020, Guangdong, China
Abstract: Objective To study the construction of heterogeneous decellularized dermal matrix-free jejunal complex, in order to solve problem of intestinal secretion after the reconstruction of long-segment trachea with free jejunal graft. Methods A total of 10 adult mongrel dogs were involved. We cut the heterogeneous decellularized dermal matrix into suitable diameter, put it on the inner face of the jejunum whose mucous layer had been removed, and then used the Shape-memory Titanium-nickel Alloy stand to support it. On day 7, 14, 30, 90 and 180, we harvested the complex to observe the growth of epithelium with microscope. Results Of all 10 dogs, one dog died of intestinal adhesion and wound infection. The other 9 dogs lived to the end of the experiment. On day 7 and 14, we detected heterogeneous decellularized dermal matrix components, and part of free jejunal inner surface was squamous metaplasia. On day 30, 90 and 180, we did not detect any heterogeneous decellularized dermal matrix components, and almost all free jejunal inner surface was squamous metaplasia. Conclusion Heterogeneous decellularized dermal matrix with appropriate size could survive on the inner surface of the jejunum whose mucous layer had been removed and promote squamous metaplasia, thus inhibiting intestinal secretion. The Shape-memory Titanium-nickel Alloy stand could serve as a good support.
Key words: Animal experiment    Tracheal reconstruction    Free jejunum    Heterogeneous decellularized dermal matrix    Inhibition    Intestinal secretion    

修复与重建6cm以上长段气管缺损，临床工作中比较少见，处理起来非常棘手。国内外相关学者进行了长期和不懈的努力，但一直没有找到可应用于临床的成熟方法。我们近年来完成的镍钛记忆合金网状支架与游离空肠移植联合重建长段气管实验研究，取得了初步成功，重建气管由于有血管供应和镍钛合金支架支撑，成活良好、可保持长期畅通。但是由于移植空肠的肠腺分泌，导致大部分实验犬出现了程度不同的肺部感染情况。2014年5月,我们完成了在去除上皮层的游离空肠基底膜表面构建异种(牛)脱细胞真皮基质——游离空肠复合体，以期用异种(牛)脱细胞真皮基质暂时覆盖游离空肠去除上皮层的内表面，最终通过鳞状上皮化生替代肠腺上皮，预防移植空肠重建气管术后肠腺分泌过多导致的肺部感染。

1 材料与方法 1.1 材料

应用直径0.2mm的镍钛记忆合金细丝，制备长60mm、外径16mm的圆筒网状支架，其外表面覆盖厚0.1cm的硅胶管膜制做覆膜镍钛记忆合金支架。 异种(牛)脱细胞真皮基质选自海奥口腔修复膜(图 1，正海生物技术有限公司，中国烟台)，主要成分为胶原蛋白。 杂种犬10只(暨南大学医学院动物实验中心提供，中国广州)，雌雄各半，1～2岁，体质量10～15kg。

图 1 异种(牛)脱细胞真皮基质 Figure 1 Heterogeneous (cattle) decellularized dermal matrix
1.2 手术过程

采用全身麻醉，将实验犬仰卧于操作台上，绷带予以固定。用络合碘消毒腹部皮肤术野，铺无菌单。于腹部正中纵行切开皮肤及皮下组织，切口长10cm左右，继续用电刀切开并向两侧牵拉腹直肌暴露腹膜，切开腹膜进入腹腔，切取7cm长带血管蒂游离空肠(图 2)。残余游离空肠两断端靠近、对位拉拢吻合,恢复肠管的通畅性。将带血管蒂的游离空肠移至腹膜外，间断缝合关闭腹膜。翻转带血管蒂的游离肠管，用大圆刀刮除其黏膜上皮层(图 3)。剪切异种(牛)脱细胞真皮基质成合适大小，无菌生理盐水充分浸泡、水化、挤压排除气泡后，平铺(覆盖)于气管内支架外表面，将气管支架连同膜状异种(牛)脱细胞真皮基质置入游离空场内，构建异种(牛)脱细胞真皮基质-游离空场与气管内支架复合体。间断分层缝合游离空肠一端，关闭该侧肠腔，另一侧放入一条硅胶引流管后也分层间断缝合关闭肠腔。将该复合体埋植于右侧腹膜外的腹壁下，分层间断缝合关闭腹部皮肤切口。 1.3 术后治疗 予苄星青霉素1支(120万单位)肌肉注射，每周1次，共2次。手术当日禁饮食，术后2d内予流质饮食，2d后改正常饮食。

图 2 剖腹、切取带血管蒂游离空肠 Figure 2 Obtaining free jejunum with vascular pedicle
图 3 翻转游离空肠并刮除黏膜上皮层 Figure 3 Turning over free jejunum and shaving mucosal epithelial layer
图 4 2周复合体去支架内面观(剪开后平铺) Figure 4 The inside view of complex 2 weeks after surgery
2 结 果

本组实验犬中有1只因肠粘连和复合体感染死亡，未能完成实验。其余9只实验犬分别于第7天、第14天、1个月、3个月4个时间点，在麻醉下分别无痛处死2只实验犬，切取复合体组织进行光学显微镜观察，于术后6个月在麻醉下无痛处死1只实验犬，切取复合体组织进行光学显微镜，观测异种(牛)脱细胞真皮基质-游离空场复合体的形态学变化情况。

术后1、2、4周肉眼观察，复合体与周围组织有些许粘连，容易分离，肠管颜色红润，血管蒂无扭转，复合体表面光滑。覆膜镍钛合金支架无移位，支架与复合体之间贴合紧密，无明显间隙，游离空肠内表面可见膜状上皮样组织覆盖(图 4)；切取部分复合体后复合体出血较多，血运好。术后 1个月时，覆膜镍钛合金支架无移位(图 5)，游离空肠内表面的膜状上皮样组织基本消失，肠内壁略呈淡红色，表面光滑；术后3个月和6个月时，复合体肠管外观颜色红润，与周围组织无明显黏连，外周未见肉芽组织增生，肠内壁外观颜色淡红，表面光滑，肠管壁内面见原贴敷的异种(牛)脱细胞上皮基质结构消失。术后1周、2周病理检查可见游离空肠黏膜层仍有部分肠黏膜上皮生长，与正常肠管黏膜上皮相比较薄，黏膜上皮层不完整，并可见少许鳞状上皮化生，术后1个月、3个月和6个月后，游离空肠内壁表面光滑，黏膜层几乎全部化生为复层鳞状上皮，肠黏膜较周围明显变短(图 6)。

图 5 术后4周复合体外面观 Figure 5 The outside view of complex 4 weeks after surgery
图 6 术后3月复合体黏膜全层病理图片 Figure 6 The pathologic picture of complex 3 months after surgery

另外，我们还同时剖腹探查了端端吻合的肠管生长情况，发现各时间点肠管吻合口均无感染，管腔均通畅、无狭窄。

3 讨 论

文献记载首例气管外科手术始于1884年，由Kuester等完成。此后，气管外科手术在世界各地不断开展和成熟，但是6cm以上长段气管缺损的修复和重建一直没有临床切实可行的方法[1]。近年来快速崛起的组织工程技术被寄予厚望，但是由于软骨细胞诱导分化和调控机制尚未明确，其临床应用还难以获得大的进展[2]。我们既往曾进行了镍钛记忆合金支架与游离空肠移植联合重建长段气管的动物实验研究[3]，该研究初步解决了重建气管的成活和管腔通畅性等问题，但是由于移植空肠的肠腺分泌导致了术后大部分实验犬出现不同程度的咳嗽、肺部感染等情况。部分学者认为移植游离空肠黏膜虽然分泌肠液，但不会引起严重的并发症[4]，但也有学者认为分泌的肠液可导致实验对象严重肺部感染，甚者可因肺功能衰竭而死亡[5]。2011年陈恩宽等[6]采取去部分黏膜游离空肠进行重建气管部分缺损的动物实验研究，结果发现肠腺分泌明显减少，但是创面修复过程较漫长。奥地利学者Rainer等[7]2001年报道，首先对大鼠的气管纤毛上皮细胞进行体外培养和扩增，10d后将培养的气管上皮细胞用特殊装置接种到制备成管状的腹直肌肌膜表面，4周后通过裸眼、显微镜和扫描电镜观察，发现管状腹直肌肌膜表面有纤毛上皮细胞生长。初步证明应用自体肌肉组织为载体，可成功地在其表面接种纤毛上皮细胞，构建腹直肌-纤毛上皮细胞复合体。受Rainer博士和陈恩宽的启发，我们设计了刮除游离空肠黏膜上皮层，在其基底膜上铺设异种(牛)脱细胞真皮基质，构建异种(牛)脱细胞真皮基质－游离空肠复合体的动物实验研究，希望使用异种(牛)脱细胞真皮基质暂时覆盖游离空肠去除上皮层的内表面，最终通过鳞状上皮化生替代肠腺上皮，以期预防游离空肠联合镍钛合金网状支架重建长段气管缺损术后游离空肠黏膜的分泌所可能引发的肺部感染。

镍钛记忆合金与人体组织有很好的相容性，理化性质稳定，对人体无不良反应。目前，镍钛记忆合金被广泛应用在医学各个领域[8-9]，已经成为医学领域中常用的生物材料。本研究采用的覆膜镍钛记忆合金支架可避免异种(牛)脱细胞真皮基质－游离空肠复合体与管腔内分泌物直接接触，保护复合体的成活。覆膜镍钛记忆合金支架可以通过牵拉使其管径变细，易于放入肠管，合适大小的弹性还可以使异种(牛)脱细胞真皮基质与去上皮的游离空肠壁紧密贴合，又不会出现肠管的缺血坏死。

复合体移至腹膜外，其血液供应由原肠系膜血管蒂提供，因而易于成活。复合体两端与腹壁组织无明显黏连，术中游离空肠肠管与腹壁组织极易分离，能很好地保持肠管外形。肠管内仍可见少量分泌物，这可能是影响异种(牛)脱细胞真皮基质在去上皮游离空肠肠壁上成活的原因之一。由于覆膜镍钛合金支架的良好的支撑作用，异种(牛)脱细胞真皮基质与肠黏膜基底层紧贴，血供良好，去上皮的肠壁可供予异种(牛)脱细胞真皮基质充足营养。术后1～2周肉眼和显微镜观测，游离空肠内表面可见异种(牛)脱细胞真皮基质存活，由于支撑架的压迫与微血管和周围纤维组织等成分逐渐长入，原异种(牛)脱细胞真皮基质逐渐化生成复层鳞状上皮。术后1个月、3个月、6个月肉眼和病理检查均未再发现异种(牛)脱细胞真皮基质成分，游离空肠内表面几乎全部化生为复层鳞状上皮。

本研究采用的异种(牛)脱细胞真皮基质是采用生物学工程技术将牛的皮肤组织经过一系列严格的脱细胞，灭活病毒等病原体，保留细胞间质成分(真皮支架)的生物膜。该生物膜的主要成分是胶原蛋白，具有特有的三维空间结构，其表面平滑，有许多呈筛状的小孔，有利于邻近组织的细胞迁入、生长和快速血管化[10-11]。本实验1、2周后就可以见到异种(牛)脱细胞真皮基质被逐渐血管化、自体组织成分替代等现象，3个月、6个月后异种(牛)脱细胞真皮基质成分几乎完全消失，被鳞状上皮化生替代。最终游离空肠肠上皮被鳞状上皮化生替代，肠上皮的腺体分泌功能被很好地抑制。

本研究中，异种(牛)脱细胞真皮基质-游离空肠复合体在腹腔外腹部皮下埋植，通过硅胶引流管与外界相通，以后在重建气管试验中，复合体通过上呼吸道与外界相通，由于生存环境有部分差异，复合体在以后的气管重建实验中的转归可能会有些许变化，由于后者空气流动更好，些许变化可能会趋向于好的方向，具体如何变化还有待进一步的实验观察。气管重建或移植动物实验或临床实际治疗中，经常会出现吻合口肉芽增生导致气管狭窄或支架移位而失败，预防肉芽增生和气管狭窄的方法除吻合口精湛的吻合技术外，吻合口置入支架扩张和压迫也是阻止和减少肉芽增生的有效措施。镍钛合金支架有一定的弹性，选择合适直径的镍钛记忆合金支架可以使支架与气管壁紧贴，避免支架移位。复合体经过1～2周后，异种(牛)脱细胞真皮基质被逐渐血管化和自体组织成分替代，3个月后成分几乎完全消失，被鳞状上皮化生替代。由于镍钛合金覆膜支架的存在和支撑早期不稳定的异种(牛)脱细胞真皮基质被紧紧贴附在肠黏膜，避免了脱落，3个月后支架去除时，异种(牛)脱细胞真皮基质几乎完全消失，被鳞状上皮化生替代，更难以脱落。我们2004年完成相关研究[3]采用精细的吻合技术和短期合适直径的镍钛合金支架置入，比较成功地预防了气管内肉芽增生、吻合口狭窄支架移位等问题。此方法应用于气管重建，不仅可以有效预防重建气管肉芽增生、狭窄和支架移位，还可以有效抑制移植空肠重建气管术后肠腺分泌，减少因此导致的肺部感染。

参考文献
[1] 寇秀娟, 陈小红. 长段气管缺损后重建的研究进展[J]. 国际耳鼻咽喉头颈外科杂志,2012, 39 (5) : 266-269.
KOU Xiujuan, CHEN Xiaohong. The research progress of reconstruction of long tracheal defect[J]. Int J Otolaryngology Head Neck Surgery,2012, 39 (5) : 266-269. (0)
[2] Du X F, Kwon S K, Song J J, et al. Tracheal reconstruction by mesenchymal stem cells with small intestine submucosa in rabbits[J]. Int J Pediatr Otorhinolaryngol,2012, 76 (3) : 345-351. (0)
[3] 马玲国, 王跃建, 何发尧, 等. 记忆合金支架与游离空肠移植联合重建长段气管动物实验研究[J]. 中华耳鼻咽喉科杂志,2004, 39 (10) : 612-614.
MA Lingguo, WANG Yuejian, HE Fayao, et al. Experimental reconstruction of the canine trachea with shape-memory titanium-nickel alloy stent coupled with free jejunal graft[J]. Chin J Otorhinolarynol,2004, 39 (10) : 612-614. (0)
[4] 郑德育, 崔鹏程, 罗家胜, 等. 游离空肠复合镍钛合金网重建犬气管的实验研究[J]. 第四军医大学学报,2008, 29 (20) : 1707-1710.
ZHENG Deyu, CUI Pengcheng, LUO Jiasheng, et al. Experimental reconstruction of the canine trachea with free jejunum coupled with nickel titanium mesh[J]. J Fourth Military Med Univ,2008, 29 (20) : 1707-1710. (0)
[5] Nakayama M. Experimental reconstruction of the trachea with free jejunal graft[J]. Nippon Kyobu Ceka Cakkai zasshi,1990, 38 : 1429-1435. (0)
[6] 陈恩宽, 王跃建, 宋文光, 等. 去部分黏膜游离空肠重建气管缺损肠黏膜组织学变化研究[J]. 山东大学耳鼻喉眼学报,2011, 25 (1) : 72-76.
CHEN Enkuan, WANG Yuejian, SONG Wenguang, et al. Histological research of tracheal reconstruction by free jejunal graft with the mucosa partially preserved[J]. J Otolaryngol Ophthalmol Shandong Univ,2011, 25 (1) : 72-76. (0)
[7] Rainer C, Wechselberger G, Bauer T, et al. Tansplantation of tracheal epithelial cells onto a prefabricated capsule pouch with fibrin glue as a delivery vehicle[J]. J Thorac Cardiovasc Surg,2001, 121 (June) : 1187-1193. (0)
[8] 徐辉, 王岩. 镍钛记忆合金棒用于脊柱畸形的研究进展[J]. 脊柱外科杂志,2014, 12 (2) : 120-122.
XU Hui, WANG Yan. The research progress of Nickel-titanium memory alloy rods used in of spinal deformity[J]. J Spinal Surgery,2014, 12 (2) : 120-122. (0)
[9] Artins J, Silva H, Certal V, et al. Ossiculo plasty with titanium prosthesis[J]. Acta Oto Mnolaringol Esp,2011, 62 (10) : 295-299. (0)
[10] 孙岩, 张庆泉, 张华, 等. 异种(牛)脱细胞真皮基质修复膜在耳鼻咽喉头颈外科术后缺损修复中的应用[J]. 山东大学耳鼻喉眼学报,2008, 22 (4) : 316-319.
SUN Yan, ZHANG Qingquan, ZHANG Hua, et al. Heterogenerty (cattle) acellular dermal matrix repairing mucosa in otolaryngology reconstruction surgeries[J]. J Otolaryngol Ophthalmol Shandong Univ,2008, 22 (4) : 316-319. (0)
[11] 任烨, 邓辰亮, 杨松林, 等. 脱细胞真皮基质在整形外科领域的研究及应用进展[J]. 中国美容整形外科杂志,2014, 25 (8) : 474-478.
REN Ye, DENG Chenliang, YANG Songlin, et al. The research and application progress of acellular dermal matrix in the field of plastic surgery[J]. Chin J Aesthetic Plastic Surgey,2014, 25 (8) : 474-478. (0)