2016, Vol. 30
2. 南京大学医学院附属口腔医院-南京市口腔医院耳鼻咽喉头颈外科, 江苏 南京 210008
2. Department of Otolaryngology & Head and Neck Surgery, Nanjing Stomatological Hospital, Medical College of Nanjing University, Nanjing 210008, Jiangsu, China
突发性聋(sudden sensorineural hearing loss，SSNHL)指可在数分钟至3 d内突然发生的原因不明的感音神经性听力损失，至少在相连2个频率听力下降20 dB以上，同时可伴有耳鸣和眩晕[1]。突发性聋临床上较为常见，发病率约在10～20/10万人[2]。目前其发病机制尚不明确，根据文献[3, 4, 5, 6, 7, 8]报道，可能与病毒感染、血液循环障碍、膜迷路损伤、免疫介导机制及耳蜗内细胞异常应激反应等有关。由于血-迷路屏障的存在，人们普遍认为迷路系统不易受细胞及体液免疫的影响。近年来研究[9, 10, 11]显示，内耳具有免疫应答功能，与血液系统中免疫活性因子关系密切。我们通过对突发性聋患者血清及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中炎性因子的测定研究，探讨其与突发性聋发生发展之间的关系。
1 材料与方法 1.1 研究对象2013年1月至2015年4月，南京大学医学院附属鼓楼医院收治SSNHL患者44例，其中男21例，女23例；18~65岁，平均(45.7±14.1)岁。纳入标准：①符合中华医学会制定的突发性聋诊断标准[1]，平均听阈(pure tone average,PTA，0.5~4 kHz )≥60 dB，无感音神经性聋家族史；②能提供完整病史及临床检查资料；③既往无慢性炎症病史；④无吸烟史。排除标准：①后续检查发现明确病因；②中途退出或失去随访病例。
以上SSNHL患者44例作为实验组，同时选取性别、年龄匹配的32名健康志愿者作为对照组，其中男15例，女17例，平均(45.0±13.6)岁。
本研究获得南京大学医学院附属鼓楼医院医学临床研究伦理委员会批准，并征得患者知情同意。
1.2 观察指标检测血清和PBMC上清中的TNF-α和IL-8的浓度以及PBMC细胞中TNF-α和IL-8mRNA的表达水平，从而分析炎性因子在突发性耳聋患者体内升高的意义。
1.3 血清中TNF-α和IL-8浓度的检测 1.3.1 血清制备采集两组人员清晨空腹血5 mL，常温下静置30 min后(严禁溶血) 送检，按常规步骤分离血清，置-20 ℃冰箱保存。
1.3.2 血清TNF-α和IL-8测定采用双抗体夹心ELISA法，使用检测试剂盒(R＆D Systems公司，美国)，严格按试剂盒操作说明书进行,用450 nm波长测量吸光度，根据相应的吸光度，计算TNF-α和IL-8的浓度。
1.4 PBMC上清中TNF-α和IL-8的检测 1.4.1 PBMC的培养采集患者及志愿者清晨空腹血20 mL，等体积生理盐水稀释后，加入淋巴细胞分离液(灏阳,中国天津)，密度梯度离心，收集PBMC，洗涤后，重悬于10% FBS 的RPMI l 640培养基，37 ℃、5% CO2培养。
1.4.2 PBMC上清中TNF-α和IL-8浓度的测定采用双抗体夹心ELISA法，操作步骤严格按试剂盒(R＆D Systems公司，美国)说明书进行,用450 nm波长测量吸光度，根据各自标准质量浓度制定标准曲线，在标准曲线上查找相应的值，计算TNF-α和IL-8的浓度。
1.5 PBMC细胞中TNF-α和IL-8 mRNA水平检测 1.5.1 细胞总RNA的提取用Trizol(Invitrogen公司，美国)裂解PBMC，离心，小心吸取上层无色水相，用异丙醇沉淀RNA，移除上清液，75%乙醇洗涤沉淀，简单干燥RNA，最后将提取的RNA溶解于DEPC水中，使用前用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。
1.5.2 cDNA合成按照试剂盒(Thermo公司，美国)SuperScript II First-Strand Synthesis System说明书操作，以2 μL总RNA为模板，进行逆转录，合成cDNA。
1.5.3 实时荧光定量PCR(qPCR)引物用于qPCR的TNF-α、IL-8和GAPDH的引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，各引物序列见表 1。
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表1 RT- PCR引物序列 Tab. 1 Primer sequences used for RT- PCR |
qPCR按SYBR Green PCR Master Mix(Roche，德国)说明书配置体系，进行扩增，以GAPDH作为内参，对TNF-α或IL-8的mRNA表达水平进行相对定量，PCR循环参数设定为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，58 ℃退火/延伸30 s，循环40次，扩增反应结束后,立即进行融解曲线分析,判定是否有非特异性扩增产物的存在。分别计算GR及GAPDH基因的Ct值,两者之差即为△Ct值，2-△△Ct即作为评价TNF-α或IL-8的mRNA表达水平的指标。采用7500 system SDS software 分析所得结果。
1.6 统计学处理采用SPSS 13.0软件，所测数据均以
± s表示，中重度聋、重度聋及极重度聋与听力下降关系组间比较采用ANOVA方差检验，余均采用独立样本t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。
突发性聋患者血清中TNF-α和IL-8的浓度分别为(9.04±0.56)pg/mL，(7.16±0.46)pg/mL(n=44)，与对照组(7.83±0.37)pg/mL，(6.70±0.37)pg/mL(n=32)相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见图 1。
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图1 正常人与突发性聋患者血清中TNF-α和IL-8浓度的比较 Fig. 1 Comparison of concentrations of TNF-α and IL-8 in the serum between the two groups |
突发性聋患者PBMC上清液中TNF-α和IL-8的浓度分别为(29.12±0.94)pg/mL，(24.98±1.34)pg/mL(n=44)，与对照组(25.59±1.00)pg/mL，(20.42±1.19)pg/mL(n=32)相比升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。突发性聋患者PBMC细胞中TNF-α和IL-8的mRNA表达水平(单位：2-△△Ct)分别为1.51±0.14，1.57±0.12(n=44)，与对照组1.05±0.07，1.07±0.07(n=32)相比升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 2。
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图2 正常人与突发性聋患者PBMC上清液中TNF-α和IL-8浓度及细胞中mRNA表达水平的比较(*P < 0.05，**P < 0.01) Fig. 2 Comparison of the protein and mRNA levels of TNF-α and IL-8 produced by PBMCs between the two groups |
散点图发现，PBMC上清液中TNF-α浓度及细胞中mRNA表达水平与突发性耳聋发病时间有线性相关趋势(图 3、图 4)，随后我们行相关分析及方程模拟：PBMC上清液中TNF-α浓度与突发性耳聋发病时间相关回归方程y=-0.129x+31.270(相关系数r=-0.346)，PBM细胞中TNF-αmRNA表达水平与突发性耳聋发病时间相关回归方程y=-0.10x+1.674(相关系数r=-0.176)。而PBMC上清液中IL-8浓度及细胞中mRNA表达水平与突发性耳聋发病时间没有明显线性相关趋势。
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图3 PBMC上清液中TNF-α与发病时间的关系 Fig. 3 The relationship between the concentration of TNF-α in PBMCs supernatant and the duration of SSNHL |
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图4 PBMC细胞中TNF-αmRNA表达水平与发病时间的关系 Fig. 4 The relationship between the mRNA level of TNF-α in PBMCs and the duration of SSNHL |
难治性突发性聋(refractory sudden sensorineural hearing loss)目前尚无明确定义，一般认为经过10～14 d常规治疗无效的患者，即为难治性突发性聋[12, 13, 14]。在收集的突发性耳聋患者中，初发未经治疗的患者13例，难治性患者31例。TNF-α和IL-8在PBMC上清液中的浓度分别为(29.59±2.08)pg/mL,(28.92±1.04)pg/mL及(24.04±2.72)pg/mL，(25.38±1.55)pg/mL；在PBMC细胞中mRNA的表达水平分别为1.35±0.25,1.57±0.18及1.54±0.17，1.59±0.15。以上组与组浓度之间比较均无统计学差异(P>0.05)，表明难治性突发性聋患者体内TNF-α和IL-8浓度与初发患者相比并无明显变化(表 2)。
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表2 初发患者与难治性突发性聋患者之间TNF-α和IL-8的比较 Tab. 2 Comparison of the levels of TNF-α and IL-8 produced by PBMCs between the incipient and refractory SSHL |
根据耳聋分级标准[15]，我们收集的突发性聋患者，中重度聋11例,重度聋17例,极重度聋16例。各组TNF-α和IL-8在PBMC上清液中的TNF-α和IL-8浓度分别为(29.65±2.52)pg/mL,(23.27±3.00)pg/mL;(29.2±1.33)pg/mL,(25.09±2.44)pg/mL;(28.66±1.44)pg/mL,(26.03±1.77)pg/mL。PBMC中TNF-αmRNA和IL-8mRNA的水平分别为1.70±0.30，1.29±0.16；1.51±0.22，1.64±0.18；1.37±0.24，1.70±0.24。以上组与组浓度之间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)，提示突聋患者体内TNF-α和IL-8浓度与听力下降程度无明显关系(表 3)。
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表3 TNF-α和IL-8与听力下降关系 Tab. 3 The relationship between levels of TNF-α and IL-8 and hearing loss |
突发性耳聋为耳科常见急症，其病因至今尚未明确，既往文献主要以病毒感染及内耳微循环障碍为主[16, 17]。然而，近年来研究显示内耳并非“免疫豁免”器官，免疫介导异常与突发性聋发病关系密切。由于缺乏明确的标记物及医学伦理学限制，目前对内耳免疫反应研究仍主要以动物试验为主[18]。Kassner等[19, 20]已证明突发性耳聋患者血清及外周血单个核细胞中典型炎性因子的变化可以反映内耳的病变，其炎性介质与突发性聋的发生密切相关。
根据文献报道[21]TNF-α和IL-8可通过作用于相应的靶细胞上调自身表达，并对炎性细胞产生强烈的趋化作用，使炎性细胞浸润积聚于受累组织，释放活性物质，从而产生局部炎症反应引起局部损伤。体内的TNF-α和IL-8主要来源于PBMC，因而引起体内炎症反应的各种因素均可刺激PBMC分泌TNF-α和IL-8，导致PBMC中的TNF-α和IL-8水平升高[22]。我们实验发现,突发性耳聋患者体内PBMC中的TNF-α和IL-8水平明显上升，与健康对照组比较具有统计学差异，提示炎性因子与突发性聋的发生具有相关性。由于TNF-α和IL-8在体液中水平很低，且血清检测的干扰因素较多(如难于标准化，结果易受环境影响等)及不确定性[23]，因此，我们实验中患者血清中的TNF-α和IL-8浓度与对照组无统计学差异。
我们通过散点图发现,PBMC上清液中TNF-α浓度及细胞中mRNA表达水平与突发性耳聋发病时间之间有线性相关趋势，随着时间延长，逐渐下降，但这种线性关系的相关度并不高，TNF-α的减少也不显著，而IL-8的这种趋势更加不明显。结合我们对TNF-α和IL-8与难治性突发性聋关系的研究，发现难治性突发性聋患者体内TNF-α和IL-8的水平虽经一段时间治疗后，仍维持在较高水平，并未明显下降。目前糖皮质激素是治疗突发性聋的首选药物之一，但其效果个体差异较大[24, 25, 26]，而Tom等[27]在小鼠试验中发现TNF-α具有抑制糖皮质激素受体功能的作用，因此，我们认为TNF-α的浓度维持在较高水平可能对糖皮质激素治疗突发性聋的效果产生不利影响，这可能是难治性突发性聋临床疗效不佳的原因之一。IL-8升高是否存在类似机制尚未见报道，需要进一步深入研究。此外我们研究还发现TNF-α和IL-8浓度与听力下降程度无显著相关性，说明炎性因子浓度并非听力下降程度的主要原因。
综上所述，突发性聋的发病机制与免疫炎症反应具有相关性，TNF-α和IL-8作为典型的细胞炎性因子，在突发性聋的诊断和治疗过程中值得重视。因此，在治疗突发性聋时不仅需要扩张血管、营养神经、溶血栓、能量合剂等传统的综合治疗，还应针对炎症介质过度的产生和释放，根据不同的临床表现，加强对免疫系统的治疗。当然，在本实验中，我们并没有深入研究炎性因子浓度变化与治疗效果之间的相关性，将在以后的实验中逐步完善，增加此方面的研究。
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